Роль вариантов нуклеотидной последовательности гена СYP2C19 в оценке ответа на антиагрегантную терапию ингибиторами P2Y12-рецепторов у пациентов старческого возраста с острым коронарным синдромом

Введение

На сегодняшний день сердечно-сосудистые заболевания занимают лидирующее положение среди причин смертности в мире¹. При оценке данных смертности населения от болезней системы кровообращения в Российской Федерации за 2022 г. сердечно-сосудистая патология по-прежнему занимает первое место [1]. На ишемическую болезнь сердца (ИБС) приходится 451,0 тысяча человек, что делает ИБС, включающую инфаркт миокарда и его осложнения, ведущей причиной смертности [1][2]. Согласно рекомендациям ESC (The European Society of Cardiology) по ведению пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС), ключевая роль отводится назначению антиагрегантной терапии [3].

Согласно классификации Всемирной организации здравоохранения, выделяют следующие возрастные группы: молодой возраст (18-44 лет), средний возраст (45-59 лет), пожилой возраст (60-74 года), старческий возраст (75-90 лет), долгожители (старше 90 лет)². Для пациентов старческой возрастной группы большое значение имеют полиморбидность и полипрагмазия [4], а также особенности фармакокинетики и фармакодинамики лекарственных препаратов, связанные с физиологическими процессами старения организма [5][6]. Центральное положение в патогенезе тромботических осложнений ИБС у данных пациентов занимают тромбоциты и нарушение их агрегационной функции [7], вследствие чего важнейшим компонентом терапии становится назначение антитромбоцитарных препаратов — ингибиторов P2Y₁₂‑рецепторов [8].

Вариабельность ответа на терапию ингибиторами P2Y₁₂‑рецепторов связана как с генетическими, так и негенетическими факторами. К негенетическим факторам можно отнести анамнестические данные пациента (возраст, вес, пол, количество тромбоцитов и гематокрит), коморбидные состояния и сопутствующую терапию [9][10]. Генетические факторы включают в себя варианты нуклеотидной последовательности (ВНП) генов, кодирующих информацию о белках на разных этапах, принимающих участие в биотрансформации антитромбоцитарных препаратов [11]. Одним из таких генов является CYP2C19, кодирующий изофермент, относящийся к семейству цитохромов Р450 [12]. Референсный аллель CYP2C19*1 ассоциирован с нормальной активностью фермента, тогда как CYP2C19*2 (NM_000769.4:c.681G>A; rs4244285) и CYP2C19*3 (NM_000769.4:c.636G>A; rs4986893) приводят к снижению метаболической активности CYP2C19, замедляя биотрансформацию ряда лекарственных препаратов [13]. В отличие от них, CYP2C19*17 (NM_000769.4:c.806C>T; rs12248560) усиливает активность фермента, ускоряя биотрансформацию препаратов [14]. ВНП гена CYP2C19 влияют на скорость активации клопидогрела, что может объяснить резистентность к терапии [15]. Однако тикагрелор не требует метаболической активации, поэтому его эффективность не зависит от генетической вариабельности CYP2C19 [16].

Таким образом, ВНП гена CYP2C19 являются важнейшими предикторами ответа пациента на антитромбоцитарные препараты, являющиеся ингибиторами P2Y₁₂‑рецепторов [17]. Однако стоит отметить недостаточность данных в этой области в контексте терапии пациентов старческой группы по сравнению с пациентами среднего и пожилого возраста и взаимосвязь ответа на подобную терапию с наличием соответствующих ВНП гена CYP2C19 и негенетических факторов.

Цель исследования — оценить ассоциации между носительством вариантов нуклеотидной последовательности CYP2C19 и ответом на применяемую антиагрегантную терапию, оцениваемым с помощью PRU у пациентов разных возрастных групп.

Материал и методы

Формирование групп

Включение пациентов в исследование проводилось на базе ГБУЗ «ГКБ №15 им. О.М. Филатова» ДЗМ.

Критериями включения были: возраст на момент госпитализации 75-90 лет для основной группы и возраст 45-74 года для контрольной группы; пациенты с ОКС; прием клопидогрела или прием тикагрелора. Критерии невключения в исследование: повышенная чувствительность к ингибиторам P2Y₁₂‑рецепторов или вспомогательным компонентам препаратов, определяемая сбором анамнеза; <24 ч после тромболитической терапии; тромбоцитопения (<150 × 10⁹); активное кровотечение любой локализации; кардиоэмболический инсульт; геморрагический инсульт; заболевания, располагающие к кровотечению (язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки в стадии обострения, язвенный колит, туберкулез, опухоли легких, гиперфибринолиз); портальная гипертензия с варикозным расширением вен пищевода; печеночная недостаточность средней и тяжелой степени (классы В и С по шкале Чайлд–Пью); хроническая болезнь почек 4-5 стадии (скорость клубочковой фильтрации <30 мл/мин/1,73 м²; клиренс креатинина <30 мл/мин); гемофилия; геморрагический диатез; дефицит витамина К; дефицит глюкозо‑6‑фосфатдегидрогеназы; наследственная лактазная недостаточность и глюкозо‑галактозная мальабсорбция.

В исследование было включено 140 пациентов с впервые возникшим или повторным ОКС, принимающие ингибиторы P2Y₁₂‑рецепторов. Основная группа: 70 пациентов от 75 до 90 лет (старческий возраст), 35 принимали клопидогрел, 35 — тикагрелор. Контрольная группа: 70 пациентов от 45 до 74 лет (средний и пожилой возраст), 35 принимали клопидогрел, 35 — тикагрелор. Далее пациенты также были разделены на подгруппы в зависимости от уровня PRU (PRU=85-208; PRU> 208; PRU< 85), от принимаемого препарата и значения PRU, от уровня PRU и генотипа по локусам CYP2C19*17 и CYP2C19*2. Объединение больных в группы, где есть пациенты, принимающие как клопидогрел, так и тикагрелор, необходимо для акцентирования внимания на возрастных особенностях ответа организма при применении препаратов ингибиторов P2Y₁₂‑рецепторов.

Определение активности тромбоцитов

Уровень остаточной реактивности тромбоцитов, единицей измерения которого является PRU — это параметр, оценивающий эффективность антиагрегантной терапии. Согласно обновленным рекомендациям международного консенсуса, диапазон остаточной активности тромбоцитов после применения антиагрегатной терапии при использовании прибора VerifyNow составляет 85-208 PRU [9].

Золотым стандартом оценки активности тромбоцитов является световая агрегометрия [18][19]. В представленном исследовании антитромбоцитарный эффект клопидогрела и тикагрелора оценивался агрегометром VerifyNow P2Y₁₂ («Аccumetrics», США). Измерение PRU осуществлялось однократно на 2-е сутки пребывания в стационаре после приема ингибитора P2Y₁₂‑рецепторов. Преимущества метода: прикроватная оценка, простота и быстрота выполнения, отсутствие прямого контакта с кровью. Недостатки: влияние гематокрита и тромбоцитопении на результат [19]. «Терапевтическое окно» для метода оценки активности тромбоцитов VerifyNow составляет PRU=85-208 (PRU>208 — риск тромботических осложнений, PRU <85 — риск геморрагических осложнений) [9].

Генетическое тестирование

Биологическим материалом для экстракции геномной ДНК являлось 4-6 мл венозной крови, взятие которой осуществлялся из локтевой вены в вакуумную пробирку VACUETTE® (GreinerBio-One, Авcтрия). Выделение геномной ДНК из цельной крови осуществлялось с помощью набора реагентов S-Сорб для выделения ДНК на кремниевом сорбенте (ООО «Синтол», Россия). Носительство аллелей CYP2C19*2 (NM_000769.4:c.681G>A; rs4244285) и CYP2C19*3 (NM_000769.4:c.636G>A; rs4986893) определялось с помощью коммерческих наборов реагентов для определения соответствующих ВНП гена (ООО «Синтол», Россия). Носительство аллеля CYP2C19*17 (NM_000769.4:c.806C>T; rs12248560) определялось с помощью коммерческих наборов «TaqMan®SNP Genotyping Assays» и TaqMan Universal Master Mix II, no UNG (Applied Biosystems, США). В результатах представлены генотипы пациентов по каждому варианту, включенному в анализ.

Статистический анализ

Статистический анализ и визуализация полученных данных проводился с использованием среды для статистических вычислений R 4.4.1 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия). Описательная статистика представлена в виде абсолютной и относительной частот для категориальных переменных и медианы (1‑й и 3‑й квартили) — для количественных переменных с распределением отличным от нормального. Соответствие выборочного распределения количественных переменных нормальному распределению проводилось с использованием теста Шапиро–Уилка [21]. Кроме того, производилась оценка коэффициента асимметрии в качестве дополнительной проверки на нормальность, поскольку исследуемая выборка небольшая (в качестве критического значения использовали абсолютное значение коэффициента >1,96). Для сравнения двух групп в отношении количественных показателей с распределением отличным от нормального использовался тест Манна–Уитни. Для сравнения групп в отношении категориальных показателей использовались тест χ² Пирсона и точный тест Фишера (при минимальном ожидаемом количестве наблюдений в ячейках таблицы сопряженности <5). Различия считали статистически значимыми при p <0,05. Проверка соответствия распределения частот генотипов закону Харди–Вайнбергу проводилась с использованием теста χ² Пирсона.

Результаты

Клинико-демографическая характеристика пациентов групп сравнения и состав проводимой лекарственной терапии представлены в табл. 1.

Значение PRU у пациентов старческого возраста (120,9 (48,5; 205,0)) на 2-е сутки было статистически значимо выше (р=0,03), чем в группе контроля (96,06 (17,0; 174,5)). Такая же тенденция наблюдалась во всех случаях сравнения по подгруппам в зависимости от применяемого препарата, значения PRU были статистически значимо выше в основной группе пациентов (для клопидогрела значение PRU в основной группе составило 186,9 (132,0; 227,0), в контрольной — 93,2 (64,0; 106,0), p=0,001; для тикагрелора значение PRU в основной группе составило 74,6 (27,0; 174,5), в контрольной — 39,3 (11,0; 46,0), р=0,001).

В табл. 2 представлены результаты сравнительного анализа для оценки статистически значимых различий в количестве пациентов, вошедших в представленные группы после измерения PRU. Пациенты старческого возраста статистически значимо чаще имеют значение PRU >208. Также был проведен сравнительный анализ основной и контрольной группы в подгруппах по препарату в зависимости от значения PRU, представленный в табл. 3. В подгруппе клопидогрела наблюдалось статистически значимое различие распределения категорий PRU между группами (p=0,016): в основной группе больше пациентов с PRU >208 (45,7% vs 17,1%; p=0,01).

Распределение генотипов соответствовало закону Харди–Вайнберга для CYP2C19*17 и CYP2C19*2, за исключением CYP2C9*3. Для локуса CYP2C19*3 статистически значимых различий между основной и контрольной группой в отношении частоты генотипов и носительства аллеля А выявлено не было. В табл. 4 и 5 приведены результаты сравнительного анализа PRU в зависимости от генотипа по локусу CYP2C19*17 и CYP2C19*2, соответственно. У пациентов контрольной группы, принимавших тикагрелор, аллель T (CYP2C19*17) значимо коррелировал с более низкими значениями PRU (p=0,023), тогда как в группе клопидогрела такой зависимости не наблюдалось.

Проведен сравнительный анализ генотипов CYP2C19*17 (СС и СТ/ТТ) и CYP2C19*2 (GG и GA/АА) в основной и контрольной группах в подгруппах по препарату в зависимости от значения PRU. В отношении генотипов CYP2C19*17 (СС и СТ/ТТ) было выявлено статистически значимое различие: пациенты из основной группы с PRU>208, принимающие клопидогрел, чаще (р=0,022) являлись носителями минорного аллеля Т в локусе CYP2C19*17 (генотип CC у 32% пациентов, генотип CT/TT — 80%). В контрольной группе у пациентов, принимающих тикагрелор, выявлено, что носительство аллеля T (локус CYP2C19*17) было статистически значимо ассоциировано с меньшим уровнем PRU, однако среди пациентов, принимавших клопидогрел статистически значимой ассоциации установлено не было. Также было выявлено, что пациенты из основной группы, принимающие клопидогрел при PRU >208, статистически значимо чаще являлись носителями минорного аллеля Т в локусе CYP2C19*17. В отношении генотипа CYP2C19*2 статистически значимой ассоциации уровня PRU с носительством минорного аллеля A выявлено не было ни в одной из исследуемых подгрупп пациентов. Распределение генотипов соответствовало закону Харди-Вайнберга для CYP2C19*17 и CYP2C19*2, кроме CYP2C9*3.

Обсуждение

При сравнении PRU пациентов основной и контрольной групп на 2-е сутки пребывания в стационаре обнаружено, что у пациентов старческого возраста отмечаются более высокие значения. Аналогичные выводы были сделаны и при распределении пациентов по подгруппам в зависимости от значений PRU. Таким образом, пациенты основной группы (старческий возраст) статистически значимо чаще имеют значение PRU >208, что свидетельствует о развитии резистентности к антиагрегантной терапии и увеличении риска тромботических осложнений. Это соотносится с положением о том, что возраст — это фактор, определяющий высокое значение PRU [20][22][23].

Согласно рекомендациям международного консенсуса, установлен единый референсный интервал PRU для клопидогрела и тикагрелора, однако результаты практических исследований демонстрируют, что у тикагрелора «терапевтическое окно» смещено в сторону более низких значений [20][24-26]. В представленном исследовании медиана PRU на фоне приема тикагрелора также была <85.

Проблема оценки ответа пациента на антиагрегатную терапию и выявления генетических факторов резистентности к терапии является крайне актуальным вопросом [27][28], однако, отмечается недостаток данных об ответе на антиагрегатную терапию при наличии соответствующих полиморфизмов гена CYP2C19 в отношении группы пациентов старческого возраста.

При проведении сравнительного анализа PRU в зависимости от генотипа по локусу CYP2C19*17 в контрольной группе носительство аллеля T при применении тикагрелора было статистически значимо связано с меньшим уровнем PRU (p=0,023), однако среди пациентов, принимавших клопидогрел, статистически значимой связи установлено не было (p=0,306). Полученные данные расходятся с положением о том, что носительство аллеля CYP2C19*17 приводит к избыточной активности фермента и, соответственно, к ускорению биотрансформации лекарственного препарата [14], и, как следствие, должно ассоциироваться с меньшими значениями PRU. Получение противоположных результатов в ходе сравнительного анализа можно объяснить, с одной стороны, малым размером исследуемой выборки, а с другой стороны феноконверсией, явлением, сопровождающимся изменением пути метаболизма лекарственного препарата, несмотря на наличие определенных ВНП генов, участвующих в биотрансформации и тем самым меняющее ответ пациента на применяемый лекарственный препарат [29]. Необходимо отметить, что на ответ пациента на антиагрегантную терапию может влиять и множество других факторов, например, коморбидность пациентов старческого возраста. На фоне сахарного диабета, патогенез которого включает изменение спектра рецепторов и гликирование белков на поверхности тромбоцитов [30], изменяется реактивность тромбоцитов [31][32]. Хроническая болезнь почек также ассоциирована с изменением реактивности тромбоцитов и возможным развитием резистентности к антиагрегантной терапии [33]. Полипрагмазия, характерная для пациентов старческого возраста, также может оказывать существенное влияние на эффективность антиагрегантной терапии [34]. Пациенты из основной группы с PRU>208, принимающие клопидогрел, статистически значимо чаще являлись носителями минорного аллеля Т в локусе CYP2C19*17. Это можно связать с небольшим размером исследуемой выборки пациентов, а также с рядом факторов, которые могли повлиять на развитие резистентности к антиагрегантной терапии и которые были описаны ранее.

Пациенты контрольной и основной групп были сопоставимы по различным параметрам, включая анамнез, гемодинамические показатели, а также лабораторные параметры. Однако, необходимо отметить, что на ответ пациента на антиагрегантную терапию может влиять и множество других факторов, например, коморбидность и полипрагмазия у пациентов старческого возраста, что требует дальнейшего изучения в исследованиях.

Ограничения исследования

К ограничениям исследования можно отнести ретроспективный характер, небольшой размер выборки, потенциальные погрешности метода измерения VerifyNow, короткий период наблюдения и возможное явление феноконверсии.

Заключение

Значения PRU были статистически значимо выше в основной группе пациентов, и, несмотря на то, что имеющиеся значения PRU в группах сравнения остаются в рамках «терапевтического окна», более высокие значения характерны именно для пациентов старческого возраста. Аналогичные результаты были получены и при сравнении групп пациентов, принимающих клопидогрел. Таким образом, для старческого возраста характерны более высокие значения PRU и, следовательно, появление резистентности к антиагрегантной терапии.

У носителей аллеля T в локусе CYP2C19*17 наблюдается связь с уровнем тромбоцитарной реактивности: у пациентов, принимавших тикагрелор, наблюдались более низкие значения PRU, тогда как у пациентов, принимавших клопидогрел, из основной группы при PRU >208 носительство минорного аллеля T встречалось чаще, что указывает на возможное влияние генетических факторов на эффективность антиагрегантной терапии и требует подтверждения в более крупной выборке.

Отношения и Деятельность. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации, тематика государственного задания «Разработка фармакогенетической тест-системы для повышения эффективности и безопасности фармакотерапии пациентов кардиологического и психиатрического профилей» (ЕГИСУ НИОКТР №124021200054-3).

Relationships and Activities. This work was carried out with the financial support of the Ministry of Health of the Russian Federation, the subject of the state assignment “Development of a pharmacogenetic test system to improve the effectiveness and safety of pharmacotherapy for patients with cardiological and psychiatric profiles” (EGISU R&D No. 124021200054-3).