Интеграция технологий биобанкирования в протоколы крупномасштабных проспективных эпидемиологических исследований

Введение

Биобанк — это коллекция биологических материалов и связанной с ними информации, которая надежно хранится в организованной системе в соответствующих условиях для текущего или будущего использования в популяционных и клинических исследованиях [1][2].

В настоящее время биобанки по всему миру становятся платформой для проведения широкого спектра исследовательских проектов, включая крупные популяционные проекты по изучению распространенности различных заболеваний, генов лекарственной устойчивости и т.д. Использование биоматериалов, собранных, обработанных и хранящихся в соответствии с едиными правилами и стандартами, гарантирует достоверность и воспроизводимость получаемых результатов¹ [3]. Роль биобанка как структуры, регламентирующей сбор биоматериалов в соответствии с утвержденными стандартными операционными процедурами (СОП) в организации популяционных исследований чрезвычайно высока.

С 2012 г. Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр терапии и профилактической медицины» Министерства здравоохранения Российской Федерации (НМИЦ ТПМ) проводит масштабное эпидемиологическое исследование ЭССЕ-РФ, посвященное изучению распространенности сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), биологических и поведенческих факторов риска ССЗ и их ассоциаций с различными экономическими и климатогеографическими характеристиками с целью определения профиля каждого российского региона в отношении распространенности и риска развития ССЗ. В настоящее время проведены три этапа этого исследования в 41 регионе Российской Федерации (РФ). Исследование включало три аспекта сбора информации: опрос участников с использованием специально разработанной анкеты, инструментальные измерения и лабораторную диагностику. Для лабораторных исследований биологический материал был собран в каждом регионе и доставлен в биобанк НМИЦ ТПМ. Реализация первого этапа данного исследования позволила сформулировать необходимость разработки более современного, регламентированного подхода к организации процедур сбора, обработки и транспортировки биообразцов из различных, в том числе географически удаленных регионов страны, в централизованную структуру для создания уникальной коллекции качественного биоматериала для дальнейшего ответственного хранения и лабораторных исследований.

Создание биобанка в соответствии с требованиями международных стандартов, являющегося центром систематического сбора и ответственного хранения коллекций высококачественных биологических образцов и соответствующей клинической и другой информации, обеспечивает качественное проведение научных работ, связанных с использованием биоматериала, как в рамках крупномасштабных эпидемиологических проектов, так и других исследовательских проектов.

Цель работы — представить опыт разработки и внедрения методов биобанкирования для эпидемиологических исследований, а также применения технологии биобанкирования и участия биобанка, созданного на базе национального медицинского исследовательского центра, в проведении крупномасштабного эпидемиологического исследования с целью повышения эффективности и качества его выполнения, а также обеспечения возможности проведения проспективных исследований.

Материал и методы

При проведении первых двух этапов ЭССЕ-РФ мужчины и женщины в возрасте 25-64 лет и 35-74 лет на последующем этапе были включены в систематическую стратифицированную многоступенчатую случайную выборку, которая формировалась по территориальному принципу на базе лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) по методу Киша [4-7]. В структуре формирования выборки первичными выборными единицами являлись поликлиники и иные ЛПУ, расположенные на территории проведения исследования, вторичными — врачебные участки, третичными — домохозяйства или отдельные члены домохозяйств.

Все этапы популяционного исследования ЭССЕ-РФ выполнялись в соответствии с этическими положениями Хельсинкской декларации и Национальным стандартом Российской Федерации «Надлежащая клиническая практика Good Clinical Practice (GCP)» ГОСТ Р 52379-2005 и получили одобрение этического комитета ФГБУ НМИЦ ТПМ Минздрава России на проведение исследования в регионах РФ. Каждый участник, обследованный в ходе исследования ЭССЕ-РФ и его последующих этапов, подписал информированное согласие на участие в исследовании и на хранение биоматериалов для использования только в исследовательских целях на неограниченный период времени.

Все участники прошли обследование, включающее анкетирование и инструментальные измерения, а также сбор и обработку венозной крови для проведения лабораторных анализов.

Анкетирование проводилось с использованием специального вопросника, разработанного модульным образом на основе валидированных методов для эпидемиологических исследований. Анкета содержала более 200 различных вопросов об образе жизни, социально-экономических условиях, заболеваниях, лечении и различных факторах риска.

Инструментальные измерения включали параметры роста, веса, окружности талии и бедер, артериального давления, частоты сердечных сокращений и, в некоторых регионах, оценку силы мышц кисти, регистрацию и анализ электрокардиограммы.

В рамках проведения первого этапа ЭССЕ-РФ с целью сохранения и структурирования собранного биоматериала в 2014 г. был создан биобанк, соответствующий мировым стандартам.

Подготовка к последующим этапам включала расширение инфраструктуры биобанка: были спроектированы, введены в эксплуатацию новые помещения и дополнительное оборудование в соответствии с международными практиками в области биобанкирования. Безопасное хранение собранных биообразцов в необходимых условиях обеспечивается с помощью современного оборудования, включая низкотемпературные морозильные камеры (-80 °C), автоматизированную систему непрерывного мониторинга, бесперебойного питания и программного обеспечения, которое позволяет систематизировано и безопасно хранить большой объем данных, связанных с биообразцами. Сотрудники биобанка разработали методологию сбора, подготовки биообразцов и транспортировки биоматериалов из регионов в биобанк НМИЦ ТПМ (центральный биобанк). В каждом регионе было организовано по два пункта сбора и пробоподготовки и временного хранения биоматериала.

Качество биообразцов и связанных с ними данных, хранящихся в биобанке НМИЦ ТПМ, подтверждено международным сертификатом соответствия ISO 9001:2015².

Результаты

Интеграция биобанкирования в протокол исследования

На основе анализа опыта проведения ЭССЕ-РФ (2012-2014 гг.) и данных литературы был разработан усовершенствованный протокол для эпидемиологического исследования, включающий новый раздел — планирование и организация биобанкирования образцов крови и ее производных.

Оснащение региональных пунктов сбора биоматериала

Для сбора биообразцов во всех регионах-участниках исследования использовался стандартный набор оборудования и расходных материалов. Это позволило минимизировать влияние технических характеристик и настроек используемого оборудования на качество образцов. В каждом пункте сбора, обработки и временного хранения биообразцов были размещены: центрифуга лабораторная среднескоростная с охлаждением, морозильная камера с температурой хранения -25 °С, компьютер с установленным программным обеспечением и доступом к сети Интернет, сканер для считывания штрихкодов, дозаторы переменного объема с одноразовыми наконечниками, вакуумные системы для забора крови, штативы и криопробирки с 2D-штрихкодами.

Разработка единой цифровой платформы

Для проведения масштабного исследования была разработана и использована «Инструментальная цифровая платформа наукоемких биомедицинских исследований» (единая цифровая платформа), объединяющая в базу данных информацию о биологических образцах и донорах.

Платформа предназначена для автоматизации процессов проведения высокотехнологичных биомедицинских исследований, в том числе:

• обеспечение организации и планирования биомедицинских исследований;
• контроль доступа на основе ролевой модели управления;
• использование для разработки информационно-регистрационных карт;
• обеспечение ввода первичных данных с использованием опросных методов и информационно-регистрационных карт;
• проведение предварительного контроля данных исследования;
• проведение валидации и контроля качества данных и биообразцов;
• статистическая обработка данных исследования;
• использование инструментальных средств для анализа данных исследования;
• обеспечение проведения интеграции (обмена данными) со смежными информационными медицинскими, лабораторными системами, и системами хранения биообразцов.

Разработка СОП и обучение персонала

СОП были разработаны сотрудниками биобанка НМИЦ ТПМ для регламентированного сбора биоматериала в регионах, транспортировки в биобанк с соблюдением холодовой цепи и поступления биоматериала в биобанк в соответствии с протоколом исследования, основанном на международных стандартах биобанкирования³, этических стандартах и анализе данных литературы [8]. В этих документах подробно описаны инструкции по выполнению процедуры взятия крови, этапам пробоподготовки образцов, внесению информации в базу данных исследования, подготовке биоматериала к транспортировке в биобанк, а также условия транспортировки и правила приема биоматериала в биобанк. На основе разработанных СОП в каждом регионе провели обучение сотрудников с использованием видеозаписей и презентаций.

В этой статье представлен регламент биобанкирования, который был разработан, валидирован в трех регионах и применялся в многоцентровых исследованиях ЭССЕ-РФ. Общая схема этапов биобанкирования, включенных в протокол исследования, представлена на рис.

Основные этапы биобанкирования

Процедура взятия крови

Процедуру взятия периферической (венозной) крови проводили в соответствии c действующими рекомендациями и стандартами⁴ в маркированные специальными этикетками вакуумные пробирки [9]. Каждая этикетка содержала закодированную информацию об идентификационном номере участника.

Пробирки с активатором свертывания крови использовали для получения сыворотки; стандартные пробирки с двукалиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) использовали для сбора цельной крови и получения плазмы; пробирки, содержащие цитрат натрия (3,2%), использовали для получения другого типа плазмы.

Пробоподготовка образцов сыворотки и плазмы крови

Процедура пробоподготовки образцов включала центрифугирование крови и аликвотирование сыворотки и плазмы. Пробирки, содержащие цитрат натрия, для исследований системы гемостаза, центрифугировали не позднее 30 мин после взятия крови, пробирки для получения сыворотки и плазмы с ЭДТА — не позднее 1 часа. Использовали стандартный режим центрифугирования [10][11].

Биологические образцы сыворотки и плазмы аликвотировали автоматической пипеткой с одноразовыми наконечниками в криопробирки, маркированные заводскими линейными штрихкодами на боковой части и 2D-штрихкодами на дне. По протоколам исследований от каждого участника было получено от 4 до 6 аликвот сыворотки по 0,5-1,0 мл, не менее двух аликвот плазмы с ЭДТА по 0,5-1,0 мл и не менее двух аликвот плазмы с цитратом натрия по 0,5-1,0 мл. В процессе пробоподготовки образца время начала центрифугирования и замораживания, а также количество и объем полученных аликвот фиксировали в специальную форму на бумажном носителе «Информация о биообразцах».

Для генетических исследований сохраняли пробирки, содержащие цельную кровь с ЭДТА и клеточный осадок, полученный после центрифугирования таких пробирок и отбора плазмы не ниже уровня лейкоцитарного слоя.

Полную информацию о каждом образце вносили в базу данных проекта при сканировании штрихкодов на этикетках вакуумных пробирок и криопробирок через специальную маску ввода в единую цифровую платформу, привязывая к идентификатору соответствующего участника исследования.

Замораживание

После регистрации в базе данных все образцы помещали в морозильную камеру с температурой -25 °С в специальных штативах. Известно, что при указанной температуре можно хранить пробы плазмы и сыворотки крови не более 3 нед., поскольку показано, что хранение в данных условиях в течение этого срока не оказывает существенного влияния на качество этого биоматериала [12-14]. Для длительного хранения при температуре -72 °C, в соответствии с принятым стандартом, полученный биоматериал транспортировали в центральный биобанк [13].

Подготовка к транспортировке

Для формирования транша в региональном пункте сбора биоматериала в программе единой цифровой платформы формировали список биообразцов, готовых к отправке, в виде таблиц в формате Excel. В соответствии с этим списком подготавливали пакет документов: информированное согласие (по 2 для каждого участника), формы «Информация о биообразцах», список идентификационных номеров и акт передачи биообразцов с информацией о количестве пробирок и штативов.

Транспортировка биоматериала в центральный биобанк

Из региональных пунктов сбора образцы доставляли транспортной компанией в центральный биобанк каждые 3 нед. в контейнерах с сухим льдом при температуре -70 °C. Для непрерывного контроля температуры внутри транспортного контейнера на всех этапах транспортировки использовали регистраторы температуры. Менеджер биобанка согласовывал дату транспортировки готового транша с транспортной компанией и координировал доставку биоматериала. В рамках процедуры управления рисками договор был заключен с двумя транспортными компаниями.

Во время транспортировки биообразцы сопровождались подготовленным пакетом документов.

Прием биоматериала, поступающего из регионов, в центральный биобанк

В центральном биобанке осуществляли прием и регистрацию поступающих биообразцов и сопроводительных документов. При приеме биоматериала в центральном биобанке оценивали целостность транспортного контейнера, соответствие объема сухого льда количеству биоматериала, проверяли наличие и исправность температурного датчика, вносили информацию о дате и времени приема в транспортной накладной. При размещении биообразцов в морозильные камеры в информационной системе центрального биобанка регистрировали информацию о идентификационном номере образца, его типе и местоположении в хранилище [11].

Передача биоматериала в клинико-диагностическую лабораторию для проведения исследований

Для проведения лабораторных исследований, запланированных по проекту, полученный из регионов биоматериал, с определенной согласованной периодичностью, передавали из биобанка в клинико-диагностическую лабораторию НМИЦ ТПМ. Пример лабораторных тестов, выполненных в рамках одного из трех этапов проекта, представлен в табл.

Результаты анализов автоматически заносились в базу данных на единой цифровой платформе и были доступны как научным сотрудникам для статистической обработки, так и врачам ЛПУ в регионах-участниках для передачи результатов лабораторных тестов в формате бланка обследованным участникам. При необходимости проведения дополнительных, вновь запланированных или проспективных исследований с использованием сохраненных биообразцов из биобанка выдавали аликвоты биоматериала в соответствии с утвержденным регламентом.

Обеспечение качества и контроль качества

Регламент биобанкирования соответствовал требованиям внедренной в биобанке системы менеджмента качества ISO 9001:2015. Точность следования разработанным инструкциям явилась основополагающим фактором, влияющим на качество биообразцов, доступность, полноту и достоверность связанных с ними данных. Своевременное выявление несоответствий и информирование сотрудников региональных ЛПУ позволяло оперативно разрабатывать корректирующие мероприятия, контролировать выполнение каждого этапа процесса биобанкирования и снизить вероятность повторного возникновения ошибок [1].

Разработанный протокол был валидирован в трех географически удаленных регионах. Был проведен анализ соответствия биообразцов и связанных с ними данных из пилотных регионов требованиям разработанного алгоритма биобанкирования, протокола эпидемиологического исследования и показателей качества, разработанных в рамках системы менеджмента качества биобанка. Оценивали количество несоответствий, связанных с маркировкой биообразцов, несоблюдением временных интервалов между сбором и пробоподготовкой образцов, недостаточным объемом пробы, наличием гемолиза и хилеза, а также полнотой заполнения полей базы данных. Результаты анализа находились в допустимых пределах, доля биообразцов с этими расхождениями составила не более 1%, что подтвердило соответствие разработанного алгоритма биобанкирования требованиям протокола исследования к качеству собранных биообразцов и данных.

Создание обширной коллекции биологических образцов от репрезентативной выборки населения регионов России

Используя валидированный единый алгоритм сбора, пробоподготовки, транспортировки и накопления биоматериала из разных регионов России, в биобанке была создана коллекция образцов цельной крови, сыворотки и плазмы крови, полученной в репрезентативной выборке населения. Информация о биообразцах и донорах была собрана в единую базу данных для всех регионов-участников на цифровой платформе для высокотехнологичных биомедицинских исследований, которая в настоящее время содержит информацию из анкет, результаты инструментальных методов обследования и лабораторных тестов для всех участников трех этапов проекта. База данных биобанка содержит информацию о биообразцах, связанную с идентификационным номером образца участников и со всей остальной информацией, собранной на единой цифровой платформе. В общей сложности в настоящее время в биобанке хранятся биообразцы 79 516 участников всех этапов исследования ЭССЕ-РФ из 41 региона России. Полученная в результате коллекция биоматериала обеспечила возможность проведения высококачественных научно-исследовательских работ и стала ресурсом для планирования и проведения различных новых, в том числе, проспективных исследований.

Обсуждение

Проведение крупномасштабных эпидемиологических исследований, изучение распространенности различных заболеваний и факторов риска их развития, маркеров инфекционных и неинфекционных заболеваний, генов лекарственной устойчивости и др., является актуальным направлением медицинской науки. Сбор биоматериала для современных эпидемиологических проектов должен обеспечиваться с помощью технологии биобанкирования и биобанков, созданных как популяционные биобанки. Только использование биоматериала, собранного, обработанного и хранящегося в соответствии с едиными правилами и стандартами, гарантирует надежность, воспроизводимость и высокое качество результатов, полученных в научных исследованиях [1][10].

Наиболее известным и ярким примером организации и внедрения крупномасштабного сбора и долгосрочного хранения биообразцов и связанных с ними данных является биобанк Великобритании, в котором были собраны в период с 2006 по 2010 гг. образцы крови, мочи, слюны и др. у 500 000 британцев в возрасте от 40 до 69 лет. В результате обследования доноров и исследования биообразцов была создана уникальная крупномасштабная биомедицинская база данных генетической и медицинской информации, которая регулярно пополняется новыми данными и является неисчерпаемым ресурсом для научных исследований, доступным мировому научному сообществу. Это подтверждается большим количеством научных публикаций с использованием данных биобанка Великобритании, которые представлены в библиографической базе данных PubMed [15][16].

Не менее интересен биобанк Катара. Организаторы биобанка Катара проводят крупное проспективное популяционное когортное исследование, которое началось в 2012 г. В нем принимают участие более 60 000 мужчин и женщин старше 18 лет. Повторные визиты участников исследования проходят каждые 5 лет. По этому проекту собирают и хранят обширные данные (клинические, метаболические и фенотипические) и биологические образцы (кровь, моча, слюна, ДНК, РНК и жизнеспособные клетки). Собранный биоматериал и связанные с ним данные используются в широком спектре исследований для оценки взаимосвязи между различными факторами (диета, образ жизни, окружающая среда, генетика и т.д.) и развитием заболеваний. По запросам исследователей биобанк Катара предоставляет биоматериалы и связанную с ними анонимизированную информацию для различных биомедицинских проектов и разработок [17][18].

Материал, собранный в рамках исследований ЭССЕ-РФ, основанных на изучении репрезентативной выборки населения из 41 региона России, представляет собой ценный массив информации, который послужил основой для большого количества научных исследований и публикаций. По результатам этого масштабного проекта российская система здравоохранения и научное медицинское сообщество устанавливают приоритеты для проведения профилактических мероприятий, разрабатывают демографическую стратегию и стратегию высокого риска [19]. Сбор и хранение биоматериалов в биобанке в соответствии со строгими стандартами эпидемиологических исследований позволяет при возникновении новых научных вопросов использовать имеющиеся биообразцы для решения новых научных задач [20]. Проспективное наблюдение за когортой, сформированной из участников исследований ЭССЕ-РФ (2012-2018 гг.), позволяет изучить вклад факторов риска и уровней определенных биохимических маркеров в выживаемость в России [21]. В рамках этого масштабного проекта опубликовано большое количество работ, исследования продолжаются и будут продолжаться в будущем [22][23]. Результаты одномоментного исследования ЭССЕ-РФ были использованы для разработки показателей российского Национального проекта «Демография», для моделирования риска развития заболеваний на популяционном уровне, для оценки экономического ущерба, наносимого факторами риска, для прогнозирования экономического эффекта популяционных профилактических мер и для оценки возможности добавления новых биомаркеров в шкалы риска [24].

Собранный по проекту биоматериал и база данных позволяют проводить различные генетические исследования, связанные с изучением распространенности вариантов генов, участвующих в различных патологических процессах [25-29]. Так, например, данные, полученные в рамках исследований ЭССЕ-РФ, были использованы для расчета распространенности гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии и частоты носительства аутосомно-рецессивных заболеваний [26][28][29]. В перспективе планируется изучение на основе коллекции фармакогенетики в эпидемиологическом аспекте. Возможно проведение новых исследований путем формирования выборок из образцов коллекции в соответствии с критериями, в том числе в рамках консорциумов. Важным аспектом хранения образцов в биобанке является возможность расширения базы данных результатами новых исследований собранного биоматериала, а также возможность проведения проспективных исследований, пополнения базы данных в результате отслеживания состояния здоровья участников проекта и конечных точек. Традиционно, результаты обследования репрезентативных выборок российских регионов, включающие итоги анкетирования, инструментальных и лабораторных обследований, вызывают большой интерес у научного сообщества и организаторов здравоохранения. Опыт показывает, что биоматериалы, собранные от репрезентативной выборки населения российских регионов, востребованы различными специалистами для проведения широкого спектра исследований.

Подводя итоги мировой практики и опыта авторов, можно утверждать, что популяционные биобанки являются практически неисчерпаемым источником для биомедицинских исследований. Большой объем тщательно аннотированного накопленного биоматериала может использоваться для проведения исследований в течение десятилетий. Следует отметить, что чем больше аликвот сыворотки и плазмы крови, которые могут быть собраны и сохранены от каждого донора/участника исследования на этапе сбора биоматериала, тем более перспективной становится коллекция с точки зрения ее использования в научных и медицинских целях.

Заключение

Благодаря применению регламента биобанкирования при сборе, пробоподготовке, транспортировке и хранении крови и ее производных, а также использовании единой цифровой платформы для объединения баз данных всех этапов исследования, создана уникальная по структуре коллекция биоматериала от репрезентативной выборки населения России (41 регион). Биобанк является необходимым центральным звеном в организации крупномасштабных эпидемиологических исследований, связанных со сбором биоматериала. Комплексный подход к организации биобанкирования в рамках проведения ЭССЕ-РФ, включал разработку методических рекомендаций (инструкции для реализации каждого этапа и обучающие материалы для персонала) и требований к техническим средствам, необходимым для сбора, пробоподготовки, транспортировки биоматериалов в биобанк и создания базы данных. Строгое соблюдение правил биобанкирования и использование специализированного программного обеспечения гарантирует высокое качество биоматериалов и структурированного информационного сопровождения коллекции. Использование биоматериала, собранного в рамках трех этапов исследования, и обширной пополняемой базы данных, позволили провести широкий спектр исследований, в том числе проспективных. Длительное хранение биоматериала и получение новых данных об участниках исследований позволит и в будущем проводить фундаментальные и прикладные биомедицинские исследования, изучать фармакогенетику в эпидемиологическом аспекте с использованием созданной коллекции биоматериала.

Отношения и Деятельность. Статья выполнена в рамках приоритетного государственного задания «Свободно циркулирующие микроРНК плазмы крови как диагностические и прогностические биомаркеры ИБС».

Relationships and Activities. State assignment “Circulating MicroRNAs in Plasma as Diagnostic and Prognostic Biomarkers of CAD”.