Заболевания системы кровообращения, в том числе – ишемическая болезнь сердца (ИБС) на протяжении многих лет возглавляют статистику смертности как в Российской Федерации, так и в большинстве стран мира [1].

Главный этиологический фактор развития ИБС – атеросклероз коронарных артерий с последующим атеротромбозом. Известно, что воспаление, развивающееся на фоне заболевания, вносит особый вклад в патогенез атеросклероза за счет рекрутирования и адгезии циркулирующих лейкоцитов к сосудистому эндотелию с последующим образованием тромбоцитарно-лейкоцитарных агрегатов [2][3]. Повышенный уровень воспаления вследствие повышенной реактивности тромбоцитов может приводить к недостаточному ответу тромбоцитов на ацетилсалициловую кислоту (АСК) у пациентов с ИБС, что снижает эффективность вторичной профилактики и повышает риск кардиоваскулярных событий [2][3].

Определенной группе пациентов с ИБС по показаниям назначается двойная антитромбоцитарная терапия (ДАТ) – комбинация АСК и ингибитора тиенопиридина P2Y12 – клопидогрела. Одновременный прием данных препаратов приводит к взаимному усилению их действия за счет ингибирования разных путей индукции агрегации тромбоцитов: тромбоксан А2-зависимого и АДФ-зависимого [4]. Однако даже на фоне ДАТ у некоторых пациентов сохраняется высокая агрегация тромбоцитов, что может повышать риск развития тромботических осложнений после хирургического вмешательства.

На развитие резистентности к антитромбоцитарным препаратам могут влиять полиморфизмы в генах основных тромбоцитарных рецепторов, которые играют роль в процессах адгезии, активации и агрегации тромбоцитов: ген АДФ-рецептора тромбоцитов P2RY12 (Н1/Н2, rs2046934), ген рецептора к коллагену ITGA2 (С807Т, rs1126643), ген рецептора к фибриногену ITGB3 (T1565C, rs5918), ген тромбоцитарного рецептора фактора Виллебранда GP1BA (C482T, rs6065) и ген цитохрома Р450 СYP2C19*2 (G681A, rs4244285). Изучение данных генов является важным для практики, поскольку наличие описанных выше полиморфизмов приводит к повышению агрегационной активности тромбоцитов, а это, в свою очередь, ведет к повышенному риску тромбообразования, воспаления, тем самым способствуя развитию резистентности к антитромбоцитарным препаратам [5].

Цель исследования – изучить ассоциацию нуклеотидных полиморфизмов в генах тромбоцитарных рецепторов и цитохрома Р450 с развитием резистентности к антитромбоцитарным препаратам у пациентов с ИБС.

В анализ с 2014 по 2021 гг. было включено 243 пациента с диагнозом ИБС, стабильная стенокардия II-IV функционального класса (ФК) согласно Канадской классификации, поступивших на лечение в ФГБУ «Федеральный центр сердечно-сосудистой хирургии» (г. Красноярск).

Критерии включения: стабильная стенокардия IIIV ФК, атеросклероз коронарных артерий (КА), подтвержденный результатами коронарографии, подписанное информированное согласие. Критерии исключения: почечная недостаточность (скорость клубочковой фильтрации <60 мл/мин/1,73м2 по CKD-EPI), язвенная болезнь желудка и/или двенадцатиперстной кишки в стадии обострения, непереносимость АСК и/или клопидогрела.

Всем пациентам было выполнено коронарное шунтирование (КШ), из них у 183 (75,3%) – с искусственным кровообращением, и у 60 (24,7%) – на работающем сердце. Пациенты были разделены на две группы: 140 пациентов вошли в группу на терапии АСК после КШ и 103 пациента – в группу ДАТ (АСК+клопидогрел) после КШ. Пациенты, получавшие до включения в исследование АСК, продолжили ее прием после КШ (группа АСК). ДАТ получали пациенты, у которых с момента острого коронарного синдрома (в анамнезе) не прошло 12 мес. За 5 дней до КШ больные прекращали получать антиагреганты, с первого дня после операции назначалось 100 мг/сут АСК, пациентам с ДАТ клопидогрел добавлялся к АСК на 2-3 сут (группа ДАТ).

Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики и принципами Хельсинской декларации. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого. Пациентами было подписано информированное согласие об участии в исследовании.

Всем пациентам при поступлении на фоне отмены антиагрегантов проводилось исследование агрегации тромбоцитов на оптическом агрегометре Chronolog 490 (США) с индукторами: АДФ 5 мМ и арахидоновой кислотой (АК) 1 мМ. Резистентность к АСК определялась при уровне агрегации тромбоцитов >20% после инкубации, обогащенной тромбоцитами плазмы с АСК и индукции с АК. Резистентность к клопидогрелу определялась как отношение изменения максимальной интенсивности агрегации тромбоцитов под действием 5 мМ АДФ по отношению к исходному значению (на фоне отмены клопидогрела минимум за 5 сут до КШ):

При значениях <29% пациенты определялись как резистентные к терапии клопидогрелом [6].

Для анализа полиморфизмов rs5819 гена ITGB3, rs6065 гена GP1BA, rs4244285 гена CYP2C19*2, rs1126643 гена ITGA2, rs2046934 гена P2RY12 использовалась геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов цельной крови с использованием комплекта реагентов «ДНК-экспресс-кровь» (НПФ Литех). Далее с образцами выделенной ДНК была проведена ПЦР с использованием комплектов реагентов для амплификации «SNPэкспресс-РВ» (НПФ Литех) с детекцией результатов в режиме реального времени, а также «SNP-экспресс» (НПФ Литех) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 10.0 (Statsoft Inc., США). Статистические расчеты количественных показателей включали в себя описательные статистики: среднее значение (М) и стандартное отклонение (SD), или медиана (Me) и межквартильный диапазон (25%; 75%). Проверка нормальности распределения значений проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. Для сравнения средних значений двух независимых выборок при несоответствии нормальному закону распределения применялся критерий Манна-Уитни. Для качественных показателей вычислялись следующие показатели: число наблюдений и доля (в %) от общего количества пациентов или от количества пациентов в соответствующей подгруппе. Для категориальных переменных применяли χ2-тест, а также точный критерий Фишера. Соответствие распределения генотипов закону Харди-Вайнберга оценивали при помощи точного теста Фишера с использованием портала Мюнхенского института человека генетики (https://ihg.helmholtz-muenchen.de), а также критерия χ2 Пирсона. Для оценки риска развития резистентности при наличии минорной аллели изучаемых полиморфизмов производили оценку отношения шансов. Значения считали статистически значимыми при р<0,05.

В анализ было включено 243 пациента, из них 49 (20,2%) женщин и 194 (79,8%) мужчины, средний возраст 63,4±7,2 лет. Различий по клинико-анамнестическим характеристикам среди пациентов двух групп не было, кроме наличия постинфарктного кардиосклероза (табл. 1).

Резистентность к АСК выявлена у 12,8% пациентов до КШ в группе, получавших только АСК в послеоперационном периоде, резистентность к клопидогрелу – у 25,6% пациентов с ДАТ. В ходе генетического анализа нуклеотидных полиморфизмов rs2046934 гена P2RY12, rs1126643 гена ITGA2, rs5819 гена ITGB3, rs6065 гена GP1BA, rs4244285 гена CYP2C19*2 была изучена распространенность разных вариантов у АСК-чувствительных (АЧ) и АСК-резистентных (АР) пациентов (табл. 2), а также у чувствительных (КЧ) или резистентных (КР) к клопидогрелу пациентов (табл. 3). Статистически значимых различий между этими группами по всем анализируемым полиморфизмам не было выявлено. При оценке ассоциаций носительства минорных и мажорных аллелей изучаемых полиморфизмов генов тромбоцитарных рецепторов и цитохрома Р450 с развитием резистентности к антитромбоцитарным препаратам по каждому полиморфизму в группах на терапии АСК и ДАТ не было выявлено статистически значимых различий.

Распределение частот аллелей и генотипов в изученных генах тромбоцитарных рецепторов и цитохрома Р450 у АР и АЧ пациентов на терапии АСК проверено на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (табл. 4). Выявлено, что в группе АР пациентов распределение генотипа полиморфизма rs1126643 гена ITGA2 (χ2=7,35; р=0,009) имеет отклонение от канонического распределения. Для генотипов полиморфизмов rs2046934 гена P2RY12, rs5819 гена ITGB3, rs6065 гена GP1BA, rs4244285 гена CYP2C19*2 отклонения от распределения Харди-Вайнберга не выявлено. В группе АЧ пациентов распределение генотипа полиморфизма rs2046934 гена P2RY12 (χ2=10,40; р=0,001) имеет отклонение от равновесия ХардиВайнберга. Для генотипов полиморфизмов rs1126643 гена ITGA2, rs5819 гена ITGB3, rs6065 гена GP1BA, rs4244285 гена CYP2C19*2 отклонений от распределения Харди-Вайнберга не выявлено.

При изучении распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов на соответствие закону Харди-Вайнберга в группе КР и КЧ пациентов на ДАТ определено соответствие каноническому распределению по 4 из 5 изучаемых полиморфизмов (табл. 5). Однако распределение генотипов полиморфизма rs1126643 гена ITGA2 χ2=5,90; р=0,01) имело отклонение от равновесия Харди-Вайнберга.

При сравнении агрегационных свойств тромбоцитов в группе пациентов с ИБС при приеме АСК до КШ среди носителей минорных аллелей и гомозигот по частой аллели по 4 из 5 изучаемых полиморфизмов статистически значимых отличий выявлено не было (табл. 6). Однако были выявлены статистически значимые различия при сравнении АК-индуцированной агрегации тромбоцитов среди носителей мажорной и минорной аллелей полиморфизма T1565C (rs5918) ITGB3: носители минорной аллели С имели более высокий показатель агрегации тромбоцитов по сравнению с носителями распространенной аллели T.

При сравнении агрегационных свойств тромбоцитов в группе пациентов с ИБС на ДАТ до КШ среди носителей минорных аллелей и гомозигот по частой аллели по всем изучаемым полиморфизмам статистически значимых отличий выявлено не было (табл. 7).

По литературным данным среди пациентов с ИБС жителей Западно-Сибирского региона распространенность разных вариантов генотипов полиморфизма rs2046934 гена P2RY12 составила – H1/H1 – 75,9%, Н1/Н2 – 22,9%, Н2/Н2 – 1,2%, полиморфизма rs5918 гена ITGB3 – ТТ – 62%, TС – 36,2%, СС – 1,8%, полиморфизма rs4244285 гена CYP2C19*2 – GG – 74,7%, GA – 23,5%, AA – 1,8% [7][8]. Распространенность генотипов СС, СT, ТТ полиморфизма rs1126643 гена ITGA2 среди пациентов со стабильной стенокардией напряжения составила 30,4%, 50% и 19,6%, соответственно [9]. Среди пациентов, перенесших инфаркт миокарда после 45 лет, распространенность разных вариантов генотипов полиморфизма rs6065 гена GP1BA составила: СС – 85%, СТ+ТТ – 19,5% [10]. Полученные нами результаты сопоставимы с литературными данными.

Согласно имеющимся исследованиям минорные аллели изучаемых нами полиморфизмов ассоциируют с повышением уровня агрегации тромбоцитов, развитием ИБС и резистентности к антиагрегантам, однако информация разноречива. Так, например, считается, что нуклеотидная замена C807T (rs1126643) гена ITGA2 приводит к увеличению количества рецепторов на поверхности тромбоцита, способствуя повышению агрегационной активности тромбоцитов и, как следствие, к высокому риску тромбообразования [11]. Между тем в других исследованиях было показано, что минорная аллель T не связана с высоким риском развития ИБС, а увеличение количества рецепторов GPIa/IIa не приводит к возрастанию тромботического риска [12]. Кроме того, сообщалось о возможном влиянии аллели Т на резистентность к АСК [13], однако в нашем исследовании это не подтвердилось.

Полиморфный вариант С482Т (rs6065) гена GP1BA может влиять на взаимодействие рецептора с фактором Виллебранда, тем самым способствуя тромбообразованию. Считается, что присутствие полиморфного варианта ассоциировано с риском развития инфаркта миокарда, ИБС [10], а также с развитием резистентности к АСК [14]. Однако в исследовании W. Renner и соавт. [15] ассоциаций данного варианта полиморфизма с ИБС не выявлено.

В исследовании Papp с соавт. [16] была показана ассоциация между гомозиготным генотипом по редкой аллели C полиморфизма T1565C (rs5918) гена ITGB3 и устойчивостью к антиагрегантам. Однако в работе W. Zhang и соавт. показано, что полиморфизм rs5918 не ассоциирован с резистентностью к АСК в китайской популяции [17], а также с резистентностью к клопидогрелу у жителей Западно-Сибирского региона [7].

Помимо этого, предполагается, что носительство гаплотипа H2 полиморфизма rs2046934 гена P2RY12 ассоциировано с повышенной агрегацией тромбоцитов в ответ на АДФ, а это может приводить к сниженному ответу на действие антиагрегантов [18][19]. Тем не менее, в настоящее время нет доказательств, подтверждающих подобную ассоциацию.

Полиморфизм G681A (rs4244285) в гене CYP2C19 является одним из наиболее важных и изученных механизмов резистентности к клопидогрелу, так как именно CYP2C19 играет главную роль в трансформации пролекарства [20]. Считается, что минорная аллель А полиморфизма rs4244285 приводит к сдвигу рамки считывания мРНК, в результате чего синтезируется измененный белок с низкой ферментативной активностью. Все это приводит к сниженному антиагрегантному эффекту клопидорела, а значит, и к высокому риску тромботических событий. Сообщалось о возможном влиянии аллели А на резистентность к клопидогрелу [7], однако в нашем исследовании это также не подтвердилось.

Противоречивые данные разных авторов могут быть обусловлены отсутствием стандартизации методов лабораторной диагностики агрегации тромбоцитов, что уменьшает шансы выявить генетическую связь.

В нашем исследовании в группе пациентов на терапии АСК до КШ носители минорной аллели С полиморфизма T1565C (rs5918) ITGB3 имели более высокий показатель АК-индуцированной агрегации тромбоцитов по сравнению с носителями распространенной аллели T. Нуклеотидная замена T176C гена ITGB3 приводит к изменению аминокислоты лейцина в положении 33 на пролин. Тромбоциты, несущие субъединицу β3интегрина αIIbβ3 с пролином вместо лейцина в положении 33, имеют более низкий порог активации различными агонистами, при этом наблюдается перестройка цитоскелета тромбоцитов, а также усиление сигнальных функций комплекса IIb-IIIa. Поэтому носители минорной аллели С полиморфизма T1565C (rs5918) гена ITGB3 обладают повышенным риском тромбообразования с такими последствиями, как инсульт и инфаркт миокарда [21][22].

При интерпретации данных исследования следует учитывать его моноцентровый характер, а также небольшой размер выборки, что могло оказать влияние на мощность полученных результатов.

Полиморфизмы генов P2RY12 (rs2046934), ITGA2 (rs1126643), ITGB3 (rs5918), GP1BA (rs6065), CYP2C19*2 (rs4244285) не ассоциированы с резистентностью к антитромбоцитарным препаратам как у пациентов на терапии АСК, так и при ДАТ. Кроме того, наличие минорных аллелей полиморфизмов rs2046934, rs1126643, rs6065, rs4244285 не связано с повышенной агрегационной активностью тромбоцитов до коронарного шунтирования. Однако в группе пациентов на терапии АСК носители минорной аллели С полиморфизма rs5918 гена ITGB3 имели более высокий показатель АК-индуцированной агрегации тромбоцитов по сравнению с носителями распространенной аллели T, что может приводить к активному тромбообразованию даже на фоне приема АСК.

Отношения и Деятельность. Нет.Relationships and Activities. None.

Финансирование. Исследование проведено при поддержке Сибирского федерального университета, Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, Федерального центра сердечно-сосудистой хирургии.Funding. The study was performed with the support of the Siberian Federal University, Professor V.F. VoynoYasenetsky Krasnoyarsk State Medical University, Federal Center for Cardiovascular Surgery.