Прямые оральные антикоагулянты (ПОАК) – современная группа антикоагулянтов, применяющихся у пациентов с неклапанной фибрилляцией предсердий (ФП) для профилактики тромбоэмболических осложнений после эндопротезирования коленного и тазобедренного сустава, а также лечения тромбоза глубоких вен нижних конечностей (ТГВ) и тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА) [1].

Для ривароксабана и апиксабана мишенью действия является активный центр Ха фактора в свободном состоянии и в протромбиназном комплексе (комплекс Ха, Vа и Ca2+) [2]. Связывая эти звенья, ПОАК препятствуют образованию фибрина из фибриногена и дальнейшему формированию тромба [2].

Рост потребления ПОАК, имеющих ряд преимуществ по сравнению с варфарином в виде улучшенного профиля эффективности и безопасности ассоциирован с неизбежным ростом серьёзных и даже фатальных нежелательных лекарственных реакций при применении данных препаратов – геморрагических осложнений, что подтверждается многочисленными клиническими исследованиями [3]. Во вторичном анализе многоцентровых рандомизированных клинических исследований III фазы было показано, что высокие концентрации ПОАК в плазме коррелируют с большей частотой нежелательных лечебных реакций в виде кровотечений [4-6], и наоборот, недавние обсервационные исследования выявили взаимосвязь между низкими плазменными уровнями ПОАК, измеренными в первый месяц лечения, и возникновением тромбоэмболических осложнений [7].

В вариабельность фармакологического ответа на ПОАК вносят вклад различные клиническо-демографические (возраст, нарушение функции почек, расовая и этническая принадлежность, пол, курение, межлекарственные взаимодействия, диета и др.) и генетические факторы (полиморфизм генов, кодирующих изоферменты цитохрома Р-450 и транспортеры лекарственных средств и др.) [8]. Ривароксабан и апиксабан являются субстратами P-гликопротеина (P-gp), трансмембранного белка-транспортера, который осуществляет эффлюкс антикоагулянтов из просвета желудочно-кишечного тракта, а также участвует в их печеночной и почечной элиминации и кодируется геном ABCB1 [9]. Кроме того, ривароксабан и апиксабан имеют CYP450-опосредованный метаболизм (ривароксабан, в основном, через CYP3A4 (~18%), с незначительным участием CYP2J2 (~14%), а апиксабан метаболизируется через CYP3A4 (~15%), и в меньшей степени – через CYP2C19, CYP1A2, CYP2C8 и CYP2C9 [10]. Знание фармакокинетики апиксабана и ривароксабана позволяет выделить гены-кандидаты, для оценки взаимосвязи носительства конкретных аллельных вариантов генов с риском нежелательных лечебных реакций на фоне терапии, и прежде всего – кровотечений. Соответственно, можно предположить, что носительство следующих полиморфных маркеров может повлиять на безопасность терапии апиксабаном и ривароксабаном: CYP3A4*22, CYP3A5*3, ABCB1 rs1045642 (3435С>T) и rs4148738 [11].

Таким образом, для оптимизации клинической эффективности и максимальной безопасности современной антикоагулянтной терапии необходим системный индивидуальный подход на основе фармакокинетических исследований и фармакогенетического тестирования, которые позволят прогнозировать и предотвращать развитие геморрагических осложнений у пациентов, принимающих ПОАК.

Цель исследования – изучить влияние полиморфных маркеров генов CYP3A4*22 (rs35599367) C>T и CYP3A5*3 A>G, кодирующих ферменты, метаболизирующие апиксабан и ривароксабан и ABCB1 (rs4148738) C>T, ABCB1 (rs1045642) C>T, кодирующих P-гликопротеин, а также определить влияние ингибиторов CYP3A4 и P-гликопротеина на фармакокинетику апиксабана и ривароксабана у пациентов с ФП и ТГВ, и оценить безопасность применения пероральных антикоагулянтов.

В открытое проспективное обсервационное исследование было включено 92 пациента (50 пациентов получали апиксабан и 42 – ривароксабан) с неклапанной ФП и ТГВ. В исследовании принимали участие пациенты, госпитализированные в ГКБ им. С.С. Юдина. Критерии включения: подтвержденный диагноз неклапанной ФП (отсутствие искусственных клапанов сердца); подтвержденный диагноз ТГВ; подтвержденный диагноз ТЭЛА и прием апиксабана в рекомендованных дозах. Критерии невключения: повышенная чувствительность к апиксабану или вспомогательным компонентам препарата; подтвержденный диагноз клапанной ФП (наличие искусственных клапанов сердца или митрального стеноза); нарушение функции почек с клиренсом креатинина менее 15 мл/мин или процедура диализа; тяжелая печеночная недостаточность класс В, С по Чайлд-Пью; геморрагический синдром, активное внутреннее кровотечение, внутричерепное кровоизлияние; врожденный дефицит лактазы, непереносимость лактозы, глюкозо-галактозная мальабсорбция; возраст до 18 лет; беременность или период грудного вскармливания. Все пациенты получали апиксабан (в дозах 2,5 мг 2 р/сут, 5 мг 2 р/сут или 10 мг 2 р/сут) и ривароксабан (в дозах 20 мг 1 р/сут, 15 мг 1 р/сут или 15 мг/ 2 р/сут) в соответствии с инструкцией по применению препарата. Исследование было одобрено заседанием локального этического комитета ФГБОУ ДПО РМАНПО Российской медицинской академией непрерывного профессионального образования Минздрава России (Протокол № 12 от 20 октября 2021 г.) и проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией, все пациенты дали информированное согласие на участие.

Взятие плазмы крови для измерения минимальной равновесной концентрации апиксабана и ривароксабана в плазме крови осуществлялся перед очередным приемом ПОАК (на 4-6 день от начала приема ривароксабана или апиксабана) с использованием вакуумных пробирок VACUETTE® (Greiner Bio-One, Австрия) с гепарином натрия. Определение концентрации апиксабана и ривароксабана в крови проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Пробы анализировали на жидкостном хроматографе Agilent 1200 (в составе четырехканальный насос, дегазатор подвижной фазы, термостат хроматографических колонок). В работе использовалась колонка Agilent Extend-C18 (длина 100 мм; внутренний диаметр 2,1 мм; зернение 3,5 мкм). Разделение проводили при температуре колонки 40°C. Подвижная фаза: раствор «А» (50 мл 0,1 М раствора ацетата аммония и 5 мл муравьиной кислоты разбавляли водой, деионизованной до общего объема 1 л) и раствор «Б» (50 мл 0,1 М раствора ацетата аммония и 5 мл муравьиной кислоты разбавляли ацетонитрилом до общего объема 1 л). Хроматографическое разделение проводили в изократическом режиме элюирования при соотношении компонентов «А»:«Б» 70:30. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,3 мл/мин. Объем вводимой пробы – 10 мкл. Анализ проводили в течение 7 мин. В работе использовали масс-спектрометр (тип тройной квадруполь) Agilent Triple Quad LC/MS 6410 с ионизацией электроспреем в режиме положительной ионизации. Регистрацию спектров ривароксабана проводили в режиме множественных молекулярных реакций. Давление газа распылителя 35 psi. Объемная скорость осушающего газа 11 л/мин, температура 350°C. Значение напряжения фрагментации составляло 135 В, напряжения на ячейке соударений – 25 В. Пробоподготовку проводили осаждением белков плазмы крови. Образцы плазмы размораживали при комнатной температуре, далее 100 мкл плазмы переносили в пластиковые пробирки типа Eppendorf, добавляли 250 мкл смеси метанола с 0,1% соляной кислотой в соотношении компонентов 9:1, перемешивали на встряхивателе Vortex, оставляли на 10 мин и перемешивали еще раз. Полученные образцы центрифугировали со скоростью вращения 10000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочный слой переносили в хроматографическиевиалы и помещали на автосемплер хроматографа.

Для отбора генов-кандидатов в исследование использовали данные по фармакокинетике и фармакодинамике из инструкции по применению препарата и базу данных PharmGKB [11]. Для генотипирования использовали венозную кровь, собранную в вакуумные пробирки VACUETTE® (GreinerBio-One, Автрия) с этилендиаминтетраацетатом. Носительство полиморфных маркеров генов CYP3A4*22 (rs35599367) C>T, CYP3A5*3 A>G, ABCB1 (rs4148738) C>T и ABCB1 (rs1045642) C>T определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Real-Time PCR) с помощью коммерческих наборов (ЗАО «Синтол», Россия; Thermo Fisher Scientific, США) на амплификаторе Real-Time CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, Inc., США).

Статистический анализ результатов проводился с помощью программы IBM SPSS Statistics 20.0. Все количественные переменные были проверены на нормальное распределение по критерию Шапиро-Уилка, что показало анормальное распределение данных (Z<1,0; p<0,0001). Для последующего анализа количественных переменных между подгруппами применялся непараметрический критерий Манна-Уитни, сравнение частот категориальных переменных проводилось с помощью критерия хи-квадрат Пирсона. Для подтверждения независимого распределения аллелей оценивали соответствие закону Харди-Вайнберга с использованием онлайн-калькулятора [12].

Базовая характеристика демографических, клинических и лабораторных признаков представлена в табл. 1. Группы были сопоставимы по полу и возрасту.

Полученные результаты популяционного исследования соответствовали закону Харди-Вайнберга при значении р>0,05 (табл. 2).

CYP3A4*22 (rs35599367) C>T был исключен из анализа, так как среди пациентов, принимающих апиксабан, было обнаружено всего 3 носителя аллели Т, а среди пациентов, принимающих ривароксабан – лишь 2 носителя. Аналогично этому были исключены из анализа CYP3A5*3 A>G и ABCB1 (rs1045642) C>T.

Пациенты с полиморфизмом гена ABCB1 (rs4148738)C>T были разделены на две группы: СС (n=10) и СТ+ТТ (n=40) для апиксабана и СС (n=15) и СТ+ТТ (n=27) для ривароксабана. При оценке сопоставимости сравниваемых групп пациентов статистически значимые различия по факторам, которые могут повлиять на основные и вторичные исходы, не обнаружены. При анализе Манна-Уитни не было обнаружено ассоциаций между носительством полиморфизма ABCB1 (rs4148738) C>T и остаточной равновесной концентрацией апиксабана (p=0,297). У пациентов носителей аллели Т статистически значимо концентрация ривароксабана была выше (p=0,026; табл. 3), при этом не было выявлено увеличения частоты кровотечений у носителей этого полиморфизма (p=0,666).

При оценке фармакокинетики апиксабана и ривароксабана в группах пациентов, принимавших и не принимавших препараты, которые являлись ингибиторами CYP3A4/P-gp (верапамил, амиодарон, дилтиазем), статистически значимых различий выявлено не было, хотя у пациентов, принимавших ривароксабан совместно с ингибиторами CYP3A4/P-gp, отмечалась тенденция к повышению уровня равновесной концентрации [102,6 (44;165) против 60,9 (25;80); p=0,065; табл. 4].

После статистической обработки результатов у пациентов на фоне приема апиксабана совместно с ингибитором CYP3A4/P-gp в 3,5 раза чаще встречались геморрагические осложнения, чем у тех, которые ингибиторы не принимали (57,1 % против 16,7%; р=0,004). При этом у пациентов, получавших ривароксабан совместно с ингибиторами CYP3A4/P-gp, отсутствовали ассоциации с увеличением частоты кровотечений по сравнению с пациентами, которые получали ривароксабан без ингибиторов CYP3A4/P-gp (табл. 5).

Персонализация терапии ПОАК, в том числе, апиксабана и ривароксабана, является ведущей задачей для обеспечения эффективности и безопасности применения этих препаратов. Важную роль в вариабельности фармакокинетики играют полиморфизмы генов ферментов биотрансформации (СYР3А4/5) а также белков-переносчиков (P-gp) [13]. На данный момент больших исследований в области фармакогенетики ПОАК не так много.

В нашем исследовании мы обнаружили, что у пациентов носителей генотипа CT+TT ABCB1 (rs4148738) C>T, кодирующего белок-переносчик (P-gp), статистически значимо концентрация ривароксабана в плазме крови была выше (p=0,026). По данным систематического обзора и метаанализа, проведенного Q. Xie и соавт., показано, что максимальная равновесная концентрация ниже у носителей ABCB1 rs1045642 CC, чем у носителей TT, и у носителей rs2032582 GG, чем у носителей аллеля A/T, а AUC 0-∞ ниже у носителей rs1045642 CC, чем у носителей TT [14]. В исследовании I. Gouin-Thibault и соавт. два аллельных варианта гена ABCB1 rs2032582 и rs1045642 не показали значительного увеличения пиковых концентраций ривароксабана в когорте здоровых добровольцев [15]. Авторы считают, что полиморфизмы гена ABCB1 нельзя рассматривать, как значимую детерминанту индивидуальной вариабельности фармакокинетики ривароксабана [15]. В исследованиях, проведенных Д.А. Сычевым и соавт., также не было обнаружено существенной разницы в пиковой равновесной концентрации ривароксабана между мутантными гаплотипами и дикими гаплотипами [16][17].

В нашем исследовании не обнаружено ассоциаций между носительством полиморфизма ABCB1 (rs4148738) C>T и остаточной равновесной концентрацией апиксабана (p=0,297), однако носители аллельного варианта CT+TT ABCB1 (rs4148738) C>T имели более высокие пиковые концентрации. В 2016 г. C. Dimatteo и соавт. продемонстрировали связь между интронным вариантом ABCB1 rs4148738 и увеличением пиковой концентрации апиксабана (p<0,05) [18]. В исследовании A.V. Kryukov и соавт. на выборке из 17 пациентов, получавших апиксабан в дозе 10 мг/сут, не было показано значимого влияния ABCB1 rs4148738 на фармакокинетику апиксабана [19].

Апиксабан взаимодействует с препаратами, которые индуцируют или ингибируют CYP3A4 или P-gp [20]. Фармакокинетический анализ сообщает о значительном снижении AUC∞ апиксабана с рифампицином, комбинированным индуктором P-gp и сильным индуктором CYP3A4. Снижение экспозиции препарата может привести к повышению риска тромботических исходов и снижению эффективности [21], и наоборот, комбинированные ингибиторы P-gp и сильные ингибиторы CYP3A4 повышают максимальную концентрацию и AUC∞ апиксабана, что повышает риск кровотечения [22,23]. В нашем исследовании у пациентов на фоне приема апиксабана совместно с ингибитором CYP 3A4/P-gp в 3,5 раза чаще встречались геморрагические осложнения, чем при приеме препарата без ингибиторов (р=0,004).

Ривароксабан имеет такой же профиль межлекарственного взаимодействия, как и апиксабан, поскольку он метаболизируется ферментами CYP3A4/A5 и 2J2 и также является субстратом P-gp [23]. Известно, что умеренные ингибиторы CYP3A4 и P-gp повышают концентрацию ривароксабана в плазме крови, хотя это не коррелирует с повышенным риском кровотечения у пациентов с нормальной функцией почек [24-26]. В нашем исследовании у пациентов, принимавших ривароксабан совместно с ингибиторами CYP3A4/P-gp, отмечалась тенденция к повышению уровня остаточной равновесной концентрации (p=0,065), но при этом не увеличивалась частота развития кровотечений.

Вероятно, следует избегать сочетания апиксабана и ривароксабана с сильным ингибитором CYP3A4 и P-gp, а если комбинация с сильными ингибиторами CYP3A4 неизбежна, можно обсудить возможность снижения дозы апиксабана и ривароксабана на 50% [27]. Эмпирическое снижение стандартных доз ПОАК не рекомендуется при совместном приеме с умеренными ингибиторами CYP3A4 [27].

В результате проведенного нами исследования выявлено, что у пациентов – носителей аллели Т полиморфизма ABCB1 (rs4148738)C>T остаточная концентрация ривароксабана в плазме крови была выше, а у пациентов, принимающих апиксабан совместно с ингибитором CYP 3A4/P-gp, был выше риск геморрагических осложнений в отличие от пациентов, не принимающих такие препараты. Необходимы дальнейшие исследования влияния фармакогенетики и фармакокинетики на профиль безопасности и эффективности апиксабана и ривароксабана с учетом системного подхода к оптимизации антикоагулянтной терапии ПОАК на основании фармакокинетических, фармакогенетических биомаркеров.

Отношение и Деятельность. Нет.

Relationships and Activities. None.

Финансирование исследования. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда 22-15-00251 №122060600001-4, «Персонализированное применение прямых пероральных антикоагулянтов на основе фармакогеномного подхода». Авторы не имеют других соответствующих связей или финансового участия с какой-либо организацией или предприятием, имеющим финансовый интерес или финансовый конфликт с предметом или материалами, обсуждаемыми в рукописи, кроме тех, которые были раскрыты.

Funding. This work was supported by Russian Science Foundation grant 22-15-00251 №122060600001-4, “Personalized Use of Direct Oral Anticoagulants Based on a Pharmacogenomic Approach”. The authors have no other relevant affiliations or financial involvement with any organization or enterprise that has a financial interest or financial conflict with the subject matter or materials discussed in the manuscript, other than those disclosed.