Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) — одна из основных причин смертности во всем мире (примерно 30% всех смертей в мире в год)1. Хорошо известно, что кардиометаболические факторы риска, включающие ожирение, дислипидемию и инсулинорезистентность, связаны с повышенным риском развития ССЗ [1]. Наличие данных состояний сопровождается бессимптомными нарушениями клеточного метаболизма, а клиническая симптоматика заболевания появляется только по мере прогрессирования этих нарушений.

Однако, в настоящий момент не существует маркеров нарушений обмена аминокислот и других низкомолекулярных метаболитов, которые бы отражали изменения метаболизма начиная от самых ранних этапов развития, а затем и прогрессирования ССЗ. Под данными этапами подразумевается такая последовательность событий, которая начинается с возникновения факторов риска ССЗ — дислипидемии, курения, ожирения, сахарного диабета — и продолжается в виде прогрессирующих патологических процессов, таких, как атеросклероз и ремоделирование миокарда. Формируется повышение артериального давления (АД), сосудистой жесткости, пред- и постнагрузки на сердце. Указанные патологические процессы, в свою очередь, лежат в основе прогрессирующего ремоделирования сердца, приводя как к его гипертрофии, так и к дилатации на более поздних этапах сердечно-сосудистого континуума. Патологические изменения в конечном итоге приводят к развитию ишемической болезни сердца (ИБС) и сердечной недостаточности [1].

В настоящее время понимание метаболических изменений, происходящих в органах и тканях на фоне развития ССЗ, находится на достаточно высоком уровне. Например, промежуточные метаболиты участвуют в сигнальных каскадах, влияя на профиль ацетилирования белков, которые контролируют ключевые процессы в клетке [2]. При гипертонической болезни (ГБ) и ИБС наблюдаются изменения в клеточном метаболизме, характеризующиеся снижением окисления жирных кислот и преобладанием гликолиза, а важным компонентом метаболических нарушений является изменение метаболизма ацилкарнитинов и аминокислот с разветвленной цепью (branched-chain amino acids, BCAA), таких как валин, лейцин и изолейцин [3]. ВСАА представляют собой комплекс из трех незаменимых гидрофобных протеиногенных аминокислот, которые характеризуются особой нелинейной структурой алифатической боковой цепи, за что и получили такое название [4].

Повышение уровня BCAA как в плазме крови, так и в кардиомиоцитах на фоне развития сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний было подтверждено в экспериментальных исследованиях [5-7]. Zhang L. и соавт. в 2018 г. продемонстрировали, что нарушение метаболизма кардиомиоцитов сопровождается соответствующими изменениями циркулирующих метаболитов [8]. Wagenmakers A. J. и соавт. на мышиной модели продемонстрировали влияние подавления метаболизма глюкозы на изменение катаболизма BCAA и, как следствие, повышение чувствительности сердца к ишемическому повреждению [6]. На основании этих исследований можно предположить, что уровень циркулирующих метаболитов может быть отражением нарушений тканевого метаболизма.

Широко изучена взаимосвязь изменений профиля BCAA в плазме крови с ожирением, нарушением гликемии натощак, инсулинорезистентностью, высоким АД, дислипидемией и увеличенной толщиной интима-медиа сосудов [9-15]. Li T. и соавт. продемонстрировали, что изменения в катаболизме BCAA приводят к заметному снижению поглощения глюкозы, окисления, содержания гликогена и гликозилирования белка [5]. В других исследованиях была показана взаимосвязь повышение уровней циркулирующих ВСАА как в группах пациентов с ГБ, так и с ИБС по сравнению со здоровыми лицами. Однако, в настоящий момент не ясно, различаются ли уровни циркулирующих ВСАА на разных этапах сердечно-сосудистого континуума и могут ли они служить индикаторами прогрессирования ССЗ.

Цель исследования — изучить связь между содержанием BCAA в плазме крови и различными стадиями ССЗ.

Характеристика пациентов/популяции исследования

Данное одномоментное исследование проведено в отделении кардиологии Университетской клинической больницы №1 Первого МГМУ им. И. М. Сеченова (Сеченовский университет), в период с 2018 по 2020 гг.

Критерии включения в основную группу: наличие диагностированной ГБ или ИБС, в контрольную группу включались люди без клинических и лабораторных признаков ССЗ.

Критерии исключения: вторичная артериальная гипертензия, цереброваскулярные нарушения (деменция; менее 6 мес после перенесенного острого нарушения мозгового кровообращения), острая почечная недостаточность, хроническая болезнь почек 4-5 стадии, признаки и симптомы заболевания печени, портальная гипертензия, бронхиальная астма, хроническая обструктивная болезнь легких, язва желудка или двенадцатиперстной кишки в стадии обострения, хронический панкреатит в стадии обострения, злокачественные новообразования, заболевания щитовидной железы, синдром Кушинга, сахарный диабет 1 типа, тромбоцитопения, геморрагический синдром, аутоиммунные заболевания, психические заболевания или инвалидность, алкоголизм, наркомания, токсикомания, беременность и кормление грудью.

В исследовании приняли участие 136 взрослых пациентов (рис. 1). Основную группу составили 109 пациентов с ССЗ (группа ССЗ) — с ГБ (n=61) или ИБС (n=48), в контрольную группу вошли 27 участников без клинических и инструментальных признаков ССЗ (группа без ССЗ). ГБ диагностировалась согласно клиническим рекомендациям [16], если офисное систолическое артериальное давление (АД) было ≥140 мм рт.ст. и/или офисное диастолическое АД ≥90 мм рт.ст., или пациент находился на антигипертензивной терапии. Диагноз ИБС ставился согласно клиническим рекомендация Российского кардиологического общества [17] при наличии в анамнезе верифицированной стресс-индуцированной ишемии миокарда и наличии стенозирования коронарных артерий по данным коронароангиографии/ компьютерно-томографической коронарной ангиографии или наличием в анамнезе инфаркта миокарда/реваскуляризации миокарда.

Всем участникам исследования проводилось стандартное общеклиническое обследование, включающее сбор жалоб, анамнеза заболевания, имеющейся медицинской документации, анамнеза жизни, физикальное обследование, антропометрические измерения (масса тела, рост, окружность талии), расчет индекса массы тела (ИМТ) как отношение массы тела (кг) к росту2 (м), измерение офисного АД; комплекс лабораторных обследований, состоящий из общего анализа крови, определение показателей липидного обмена (общего холестерина, липопротеидов низкой плотности (ЛНП), липопротеидов высокой плотности (ЛВП), липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП) и триглицеридов), углеводного обмена, при необходимости проведение теста толерантности к глюкозе или определение уровня гликозилированного гемоглобина, уровней креатинина с расчетом скорости клубочковой фильтрации, мочевой кислоты, печеночных трансаминаз, креатинфосфокиназы-МВ, анализ уровней гормонов щитовидной железы (для исключения гипо- и гипертиреоза); электрокардиография на электрокардиографе Shiller Cardiovit AT-02 (Shiller, Австрия); эхокардиографическое исследование при помощи аппарата Vivid 7 PRO 6.0.х (GE, Германия) в М и В режимах и в допплеровском режиме; по показаниям проводились ультразвуковое исследование почек и сонных артерий на аппаратах Logiq S7 (GE, США), 24-часовой амбулаторный мониторинг артериального давления при помощи монитора BPLab (ООО Петр Телегин, Россия), прошедший испытания точности по международному протоколу ESH-2001, 24-часовой мониторинг электрокардиографии на аппарате Schiller MT-101 (Schiller, Швейцария).

На основании проведенного обследования у части пациентов с ГБ выявлено ремоделирование миокарда (признаки диастолической дисфункции, увеличение объема левого предсердия, гипертрофия левого желудочка) (n=31; подгруппа ГБ + ремоделирование).

Принимая во внимание связь уровня BCAA с метаболическими нарушениями, такими, как ожирение, инсулинорезистентность и дислипидемия, среди клинически здоровых пациентов мы выделили подгруппу лиц, у которых отсутствовали клинические и инструментальные признаки ССЗ, но имелись признаки метаболических нарушений [ИМТ ≥25 кг/м2, дислипидемия] (n=16).

Определение аминокислот с разветвленной цепью

Образцы плазмы были взяты после ночного голодания между 8 и 10 ч утра из вены в вакуумные пробирки, содержащие дегидрат этилендиаминтетрауксусной кислоты двукалиевой соли. Сразу после этого образцы центрифугировали при 2 000 об/мин в течение 20 мин и помещали на хранение при -80OC до выполнения анализа.

Определение BCAA в плазме крови проводилось в лаборатории фармакокинетики и метаболомного анализа Института трансляционной медицины и биотехнологий ПМГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава РФ (Сеченовский университет). BCAA в плазме крови измерялись с помощью жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией. Растворители и стандарты BCAA компании Sigma-Aldrich (St. Louis, Миссури, США). Смесь изотопно-меченых аналитических стандартов (с D8-валином и D3-лейцином) была получена из набора MassChrom Amino Acids and Acylcarnitines Non Derivatised 57000 Kit (Chromsystems, Германия).

Профили BCAA в плазме крови анализировались с помощью системы высокоэффективной жидкостной хроматографии Waters Acquity I, соединенной с тройным квадрупольным масс-спектрометром Waters TQ-S-micro. (Waters Corp, Милфорд, США). Хроматографическое разделение проводилось с использованием колонки Waters ACQUITY BEH C18 1,7 мкм, 100 мм × 2,1 мм (Waters, США). Как подвижная фаза А (вода), так и фаза В (ацетонитрил) содержали 0,1% муравьиной кислоты. Линейные градиенты были следующими: 1% B в 1 мин, 20% B в 3 мин, 90% B в 5 мин, 90% B в 8 мин, 1% B в 8,1 мин и 1% B в 12 мин. Скорость потока составляла 0,3 мл/мин, а температура колонки была установлена на 40OC. Определение метаболитов проводилось в положительно-ионном режиме. Масс-спектрометрия проводилась при следующих условиях: время пребывания 0,019-0,025 сек; напряжение на капилляре 2 КВ; в качестве среды коллизионного газа использовался азот, а температура источника была установлена на 150OC. Импорт данных и предварительная обработка данных целевых MS проводились с помощью программного обеспечения Target Lynx (Waters, штат Массачусетс, США). Идентификация и количественное определение были достигнуты в режиме мониторинга множественных реакций, который в сочетании с тройными квадрупольными масс-спектрометрами нового поколения был разработан для обнаружения специфических пептидов в сложных биологических смесях, таких как плазма и сыворотка человека. В большинстве таких анализов используется ионизация электрораспылением с последующими двумя стадиями отбора масс: на первой стадии (MS1) выбирается масса интактного аналита (исходный ион) и, после фрагментации исходного иона путем столкновения с атомами газа, на второй стадии (MS2) выбирается специфический фрагмент исходного иона, в совокупности создавая мониторинг выбранной реакции [18].

Метод был проверен на селективность, линейность, прецизионность, точность, восстановление, влияние матрицы и стабильность в соответствии с рекомендациями Food and Drug Administration (США)2. Калибровочные кривые были линейными в диапазоне 1-1000 мкМ. Нижний предел количественного определения составлял 1 мкМ. Как внутри-, так и межпрогонная точность и прецизионность для всех аналитов были ниже 5,4% и 7,1%, соответственно. Эффект матрицы варьировался от 95,1% до 99,4%, а восстановление — от 93,8% до 99,1%. Все образцы были проанализированы в одной партии. Использовались средства контроля качества.

Этические аспекты

Исследование было проведено в Первом МГМУ им. И. М. Сеченова МЗ РФ (Сеченовский университет) в соответствии с этическими принципами проведения медицинских исследований с участием человека, изложенными в Хельсинкской декларации, и было одобрено комитетом по научной этике университета. Все участники предоставили письменное информированное согласие до начала исследования.

Статистический анализ

Распределение переменных для профилей BCAA было проверено с помощью одновыборочного теста Колмогорова-Смирнова. H-тест Крускела-Уоллиса и тест Манна-Уитни использовались для сравнения общих характеристик, лабораторных данных, параметров ремоделирования миокарда и профилей BCAA между группами. Зависимость количественной переменной от факторов рассчитывалась с помощью метода линейной регрессии. Для оценки различий внутри подгрупп участников по профилям ВСАА применялся односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с post-hoc тестом Шеффе. Диагностическая точность оценивалась для профиля BCAA путем расчета площади под кривой (AUC), полученной с помощью ROC-анализа при сравнении групп без ССЗ и групп с ССЗ и сравнении внутри подгрупп. AUC классифицировались как «недостаточные», «достаточные», «хорошие», «очень хорошие» или «отличные», если AUC были <0,5; от 0,5 до 0,6; 0,6-0,7; 0,7-0,8; 0,8-0,9 или >0,9, соответственно. Различия при p<0,05 считали статистически значимым. Статистический анализ проводился с использованием программ Statistica 12.0 (StatSoft Inc., США) и SPSS Statistics 23.0 (IBM, США).

Исследуемые группы не различались по полу, однако пациенты с ССЗ закономерно относились к более старшей возрастной группе (p<0,001), имели более высокий ИМТ (p<0,001) и уровень глюкозы плазмы крови натощак (p<0,01) (табл. 1). По результатам эхокардиографии: 90,8% пациентов с ССЗ имели нормальную фракцию выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ), 50,5% — диастолическую дисфункцию и 49,5% — гипертрофию ЛЖ. В группе без ССЗ подгруппа здоровых и подгруппа с метаболическими нарушениями различались по ИМТ (p<0,001) и уровню ЛНП (p<0,05). Подгруппы с ГБ и подгруппа с ИБС различались по возрасту, объему левого предсердия, уровню общего холестерина и триглицеридов (p<0,05).

Подгруппа с ГБ по сравнению с другими подгруппами ССЗ различалась по большинству эхокардиографических параметров, включая значимые различия в толщине задней стенки левого желудочка и межжелудочковой перегородки, в объеме левого и правого предсердий и наличию диастолической дисфункции (p<0,05).

Были выявлены значимые различия между профилями BCAA пациентов в группе с ССЗ и группе без ССЗ в уровнях концентрации валина, лейцина и изолейцина (табл. 2). При использовании H-теста Крускела-Уоллиса было выявлено, что уровни концентраций лейцина и изолейцина были минимальными в подгруппе здоровых участников и максимальными в подгруппе пациентов с ИБС (p<0,05). Уровень валина значимо не различался между всеми группами (p=0,118). Статистически значимых различий в концентрации BCAA в подгруппах без ССЗ обнаружено не было (табл. 3). При сравнительном анализе подгрупп ССЗ значимых различий по уровню валина выявлено не было, также как и значимых различий по всем исследуемым ВСАА между подгруппами ГБ и ГБ + ремоделирование. Однако, значимое различие продемонстрировал изолейцин как между всеми тремя подгруппами ССЗ, так и между ГБ в сравнении с ИБС и ГБ+ремоделирование в сравнении с ИСБ (табл. 4).

При проведении ANOVA с post-hoc тестом Шеффе было подтверждена статистически значимое различие между профилями всех подгрупп в уровнях лейцина (p=0,039) и изолейцина (p=0,015), а уровни валина статистически значимо (p=0,009) различались между здоровой группой и группой ИБС. Несмотря на отсутствие статистически значимых различий в уровнях исследуемых аминокислот между всеми исследуемыми подгруппами, отмечается тенденция нарастания концентраций всех ВСАА у больных ССЗ (рис. 2). Дополнительно был проведен статистический анализ зависимости уровней концентрации аминокислот с известными факторами риска развития ИБС, как ожирение, пол, возраст и курение. Несмотря на то, что отдельные показатели (наличие ожирения, пол) при использовании метода линейной регрессии показали взаимосвязь с ВСАА, однако проведение анализа с применением множественной регрессии показало, что совокупность факторов значительно не влияет на статистическую значимость полученных ранее результатов.

Расчетные площади под ROC-кривыми для BCAA в группах без ССЗ и ССЗ варьировались в пределах 0,63-0,64 (достаточная диагностическая точность). Однако рассчитанные площади под ROC-кривыми для BCAA у всех участников исследования с метаболическими нарушениями (метаболические нарушения, ГБ, ГБ + ремоделирование, ИБС) были выше и составляли от 0,70 до 0,72 (хорошая диагностическая точность) (рис. 3, табл. 5).

Авторы исследовании предположили, что изменения в метаболизме BCAA связаны с различными стадиями ССЗ. Мы обнаружили, что уровни ВСАА в плазме крови взаимосвязаны с этапами сердечно-сосудистого континуума и наиболее высокие уровни наблюдаются у пациентов с ИБС. Эти выводы были основаны на сравнении профилей BCAA у здоровых людей, людей с метаболическими нарушениями, пациентов с ГБ и пациентов с ИБС.

В первых работах, связанных с изучением BCAA, была отмечена их роль в развитии метаболических нарушений — в особенности инсулинорезистентности. В последующем как в экспериментальных, так и в клинических исследованиях данное предположение было проверено и подтвердило участие BCAA в развитие инсулинорезистентности [15]. До сих пор, однако, не совсем ясно, как метаболические пути, в которых задействованы BCAA, связаны с её развитием, однако уже было показано, что повышение уровня BCAA в плазме крови является ранним предиктором развития диабета [19].

Существуют противоречивые данные о взаимосвязи между наличием ССЗ и изменениями метаболического профиля в зависимости от общих характеристик (пол, возраст, ИМТ) и биохимических параметров (уровней липопротеинов и глюкозы в плазме). MH Mahbub с соавт. показали связь повышенного АД с увеличением концентрации BCAA, но изменения уровня этих аминокислот не были значительными после корректировки на ИМТ [20]. В то же время другие авторы продемонстрировали, что связь между повышением уровня циркулирующих ВСАА и гипертонией не зависит от ИМТ [21]. Особого внимания заслуживает проспективное популяционное когортное исследование PREVEND, в рамках которого была проведена количественная оценка уровня BCAA с помощью ядерного магнитного резонанса у взрослых преимущественно европеоидной расы (период наблюдения составил 8,6 лет). В данной работе была продемонстрирована тесная взаимосвязь между содержанием BCAA в плазме крови и развитием артериальной гипертонии, которые напрямую коррелировали с возрастом, ИМТ, курением, диастолическим артериальным давлением, глюкозой и триглицеридами плазмы. Также была продемонстрирована прогностическая роль BCAA в развитии ГБ [22].

Интересным представляется ряд исследований, оценивавших взаимосвязь уровней ВСАА с различными вариантами дислипидемии и инсулинорезистентностью [21][23]. Так, связь циркулирующих аминокислот с показателями липидного спектра не зависит от наличия инсулинорезистентности, и была продемонстрирована даже у лиц без сахарного диабета 2 типа [21]. В других работах сообщалось о корреляции уровней циркулирующих ВСАА с толщиной комплекса интима-медиа, что свидетельствует о роли измененного метаболизма ВСАА в развитии дислипидемии и, как следствие, атеросклероза [23]. Эти результаты в совокупности дают основание предположить, что метаболические изменения BCAA связаны в первую очередь с нарушениями липидного обмена и тем самым способствуют прогрессированию атеросклероза и, как следствие, развитию ИБС.

На основании результатов нашей работы, а также результатов исследований других авторов стало возможным найти патофизиологическое обоснование связи между повышением уровня BCAA и прогрессированием ССЗ. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что BCAA принимают значимое участие в регуляции липидного обмена в жировой ткани, в формировании чувствительности тканей к инсулину и, как следствие, оказывают влияние на метаболизм глюкозы. Помимо повышения чувствительности к инсулину за счет активации рецепторов mTOR, BCAA вероятно играет роль в синтезе белков, липидов, а также в аутофагии клетки [24]. Кроме того, ВСАА оказывает влияние и на процессы производства/использования энергии, питательных веществ, а также на кишечную сигнализацию посредствам toll-like рецептора 4 типа [25]. Она, в свою очередь, лежит в основе формирования хронического воспаления за счет экспрессии макрофагами интерлейкина-6, интерлейкина-10, фактора некроза опухоли α, оксида азота [26]. Известно также, что инсулинорезистентность формируется при высоком содержании жировой ткани (при морбидном ожирении) и атеросклерозе вследствие реакции на хроническое воспаление интимы сосудов. В свою очередь на фоне ожирения и инсулинорезистентности увеличивается синтез свободных жирных кислот, способствуя развитию факторов риска ССЗ [27][28]. Участвуя в регуляции всех указанных патологических процессов, ВСАА, вероятно, лежат в основе развития и прогрессирования ССЗ.

Ограничения исследования

Ограничениями нашего исследования было небольшое количество участников в подгруппах без ССЗ, более молодой возраст данной группы пациентов, неравное количество участников во всех исследуемых подгруппах.

Наше исследование показало значимое увеличение BCAA, а именно лейцина и изолейцина, на этапах по сердечно-сосудистого континуума от пациентов с наличием факторов риска, до пациентов с ГБ и ИБС. Определение концентрации BCAA в плазме крови имеет перспективы в диагностике ИБС. Тем не менее, необходимы дальнейшие проспективные исследования с целью ответа на вопрос: действительно ли BCAA являются независимыми предикторами ССЗ.

Отношения и Деятельность. Нет.

Relationships and Activities. None.

Финансирование. Исследование проведено при поддержке Первого МГМУ им. И. М. Сеченова (Сеченовский Университет).

Funding. The study was performed with the support of the I. M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University).

1. WHO Mortality Database. [cited 2021 Mar 01]. Available from: https://www.who.int/data/data-collection-tools/who-mortality-database. 2. Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry [cited by 24 May, 2018]. Available from: https://www.fda.gov/files/drugs/published/Bioanalytical-Method-Validation-Guidance-for-Industry.pdf.