Последнее время большое внимание в литературе уделяется генетическим аспектам тромбообразования. Есть данные о возможной роли в развитии резистентности к ацетилсалициловой кислоте (АСК) полиморфных вариантов генов тромбоцитарных рецепторов фибриногена (ITGB3) Т1565С, коллагена (ITGA2) С807Т, а также гена эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS3) T786C [1][2]. Роль в развитии вариабельности ответа к клопидогрелу принадлежит полиморфным вариантам генов тромбоцитарных пуринергических (P2RY12) H1/H2 рецепторов, рецепторов фибриногена (ITGB3) Т1565С и коллагена (ITGA2) С807Т, а также гена eNOS3 (T786C) и гена изофермента CYP2C19 (G681A) [1-3]. Очевидно, что влияние полиморфных вариантов некоторых генов на активность тромбоцитов и развитие высокой остаточной реактивности тромбоцитов (ВОРТ) / резистентности к двойной антитромбоцитарной терапии (ДАТТ) АСК и клопидогрелом может иметь определенную вариабельность в зависимости от конкретного региона и популяции. С другой стороны, индивидуальные генетические детерминанты имеют ограниченное клиническое значение, а их комбинированный эффект делает возможной стратификацию групп людей с высоким и низким риском развития тромботических осложнений. Поэтому изучение вклада генетических факторов в формировании ответа на АСК и клопидогрел позволит индивидуализировать подход к выбору и режиму дозирования антитромбоцитарных лекарственных средств, что повысит эффективность антитромбоцитарной терапии и снизит риск развития сердечно-сосудистых событий у пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС).

Цель исследования — изучение ассоциации полиморфных вариантов G681A (*2) гена CYP2C19, H1/H2 гена P2RY12, T1565C гена ITGB3, С807Т гена ITGA2 и T786C гена eNOS3 с ВОРТ к клопидогрелу и АСК в разные сроки инфаркта миокарда (ИМ).

В исследование включено 400 пациентов с ИМ европеоидной расы в возрасте от 31 года до 74 лет, средний возраст 58,0 [ 52,0; 65,0] лет, 317 (79,3%) мужчин и 83 (20,7%) женщины. Пациенты проходили обследование и лечение на базе Гродненского областного клинического кардиологического центра и реабилитацию на базе Гродненской областной клинической больницы медицинской реабилитации. Из них 322 пациента с Q-ИМ и 78 человек с не-Q-ИМ, 29 человек (7,2%) подвергались тромболитической терапии (ТЛТ), у 98 человек (24,5%) была выполнена ТЛТ, а в дальнейшем — процедура отсроченного чрескожного коронарного вмешательства (ЧКВ), 239 пациентам (59,8%) было выполнено первичное ЧКВ, 34 пациента (8,5%) были пролечены консервативно. Самыми частыми факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний среди исследуемых лиц были артериальная гипертензия 96,8%, гиперхолестеринемия 74,5%, курение 65,8%, отягощенная по сердечно-сосудистым заболеваниям наследственность 58,0%, ожирение 32,5%, сахарный диабет 13,0%. В прошлом перенесенный ИМ был у 15,0% пациентов.

Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики и принципами Хельсинкской декларации. Все обследуемые подписывали информированное согласие на участие в исследовании, протокол которого был одобрен комитетом по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета №3 от 13.01.2016.

Критерии включения в исследование: наличие ИМ не более двухдневной давности, лица обоего пола, информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии невключения: ИМ более чем двухдневной давности, наличие фибрилляции/трепетания предсердий, хроническая сердечная недостаточность стадии выше НIIA, наличие сопутствующих острых воспалительных и онкологических заболеваний, активное внутренние кровотечение, анемии различного генеза, количество тромбоцитов менее 150х109/л, выраженная почечная и печеночная недостаточность, отказ от участия в исследовании.

Пациенты получали терапию, включающую АСК 75 мг/сутки («Аспикард», Борисовский ЗМП, Беларусь), клопидогрел (нагрузочная доза 300 мг, поддерживающая — 75 мг/сутки; 335 человек получали «Клопидогрел» Белмедпрепараты, Беларусь, 65 человек — «Плавикс», Санофи-Авентис, Франция), низкомолекулярные гепарины (эноксапарин), аторвастатин (нагрузочная доза 80 мг, с последующим снижением до поддерживающей 20-40 мг), бета-блокаторы (бисопролол 5-10 мг, метопролол 50-100 мг), ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (лизиноприл 5-20 мг, рамиприл 5-10 мг), нитраты.

Исследование агрегации тромбоцитов проводилось при поступлении в стационар (не менее, чем через 12 часов от назначения нагрузочной дозы клопидогрела), через 12-14 и 28-30 дней от начала ИМ. Оценку агрегации тромбоцитов проводили при помощи мультиэлектродной агрегометрии на импедансном 5-канальном агрегометре Multiplate (Verum Diagnostica GmbH, Германия) с несколькими индукторами агрегации: с аденозин-5′-дифосфатом (АДФ) (ADP-test) — для выявления чувствительности к клопидогрелу, с арахидоновой кислотой (ASPI-test) — для выявления чувствительности к АСК, с пептидом-активатором рецептора тромбина (Trap-test) — для отражения потенциальной способности тромбоцитов к агрегации. Показателем, наиболее полно отражающим тромбоцитарную активность, является площадь под агрегационной кривой (area under curve — AUC), представленная в виде единиц (unit — U). ВОРТ при приеме АСК определялась по данным ASPI-test при значении AUC выше 30 U, ВОРТ при приеме клопидогрела определялась по данным ADP-test при значении AUC выше 50 U [4].

Экстракцию геномной ДНК из лейкоцитов цельной крови проводили набором реагентов «ДНК-ЭКСТРАН-1», НПК «Синтол», РФ. Молекулярно-биологическое исследование генотипов полиморфных локусов гена тромбоцитарного рецептора фибриногена ITGB3 (T1565C) rs5918 и гена фермента-метаболизатора цитохрома CYP2C19 (G681A) rs4244285, гена тромбоцитарного рецептора коллагена ITGA2 (С807Т) rs1126643 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) c флуоресцентной детекцией в режиме реального времени и с применением реагентов НПК «Синтол», РФ на амплификаторе Rotor Geene, Qiagen, Германия. Определение аллельных вариантов гена АДФ-рецептора тромбоцитов P2RY12 (T744C), rs2046934 проводили методом ПЦР с электрофоретической детекцией в камере трансилюминатора GelDocTM XR+ BioRad, США и использованием комплекта реагентов «ООО НПФ Литех», РФ. ПЦР выполнена на амплификаторе термоциклере Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler, США. Выявление полиморфного локуса T786C гена eNOS (rs2070744) осуществляли с применением набора реагентов «SNP-экспресс-РВ» «ООО НПФ Литех», РФ.

Статистический анализ данных выполнялся при помощи программы STATISTICA 10.0. Полученные результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей (Ме [LQ; UQ]) при распределении, отличающемся от нормального (нормальность распределений проверялась при помощи критерия Лиллиефорса). Две независимые группы сравнивали по численному показателю с помощью U-критерия Манна-Уитни. При сравнении долей (относительных величин) бинарных переменных между 2 или более независимыми группами использовался точный критерий Фишера (ТКФ) либо критерий χ2 с поправкой Йетса. При сравнении распределений бинарного показателя при последовательных измерениях использовался критерий Мак-Немара с коррекцией Эдвардса, с поправкой Холма-Бонферрони для pзначений. Соответствие распределения генотипов закону Харди-Вайнберга оценивали при помощи критерия χ2. Для оценки риска развития ВОРТ при наличии мутантной гетерозиготы или мутантной гомозиготы, либо при наличии гаплотипов изучаемых полиморфизмов производили оценку отношения шансов (ОШ) при помощи таблиц сопряжённости. Пороговый уровень статистической значимости был принят равным 0,05.

В исследованной выборке распределение частот генотипов генов CYP2C19, P2RY12, ITGA2, ITGB3, eNOS3 соответствовало ожидаемому равновесию Харди-Вайнберга (χ2 =0,25, р=0,61; χ2=0,34, р=0,55; χ2=0,07, р=0,79; χ2=0,8, р=0,37; χ2=0,16, р=0,69 соответственно).

Носители генотипа GG гена CYP2C19 составили 74,8% (n=299), GA — 23,7% (n=95), AA — 1,5% (n=6). Частота встречаемости аллеля G — 86,6%, аллеля A — 13,4%. Носители генотипа H1/H1 гена P2RY12 составили 60,0% (n=240), H1/H2 — 34,2% (n=137), H2/H2 — 5,8% (n=23). Частота встречаемости локуса H1 — 77,1%, H2 — 22,9%. Носители генотипа ТТ гена ITGB3 составили 74,5% (n=298), генотипа ТС — 23,0% (n=92), генотипа СС — 2,5% (n=10). Частота встречаемости аллеля Т — 86,0%, аллеля С – 14,0%. Носители генотипа СС гена ITGA2 составили 34,2% (n=137), генотипа СТ — 48,0% (n=192), генотипа ТТ — 17,8% (n=71. Частота встречаемости аллеля С – 58,2%, аллеля Т — 41,8,0%. Носители генотипа TT гена eNOS3 составили 30,8% (n=123), генотипа TC — 48,5% (n=194), генотипа CC — 20,7% (n=83). Частота встречаемости аллеля T — 55,0%, аллеля C — 45,0%.

Частота встречаемости ВОРТ к АСК, клопидогрелу, ДАТТ в разные сроки ИМ была различной (табл. 1). Обращает на себя внимание высокая встречаемость недостаточной эффективности АСК и клопидогрела у пациентов с ИМ в разные сроки наблюдения.

Для оценки ассоциации полиморфных вариантов исследуемых генов с показателями агрегометрии мы разделили пациентов на 2 подгруппы согласно рецессивной модели: подгруппу А (ПГА) составили носители «диких» генотипов, подгруппу В — носители мутантных гетерозиготы и гомозиготы.

Статистически значимые различия показателей агрегатограммы получены для полиморфного локуса G681A гена CYP2C19 для значений ADP-test1-3, для полиморфного локуса H1/H2 гена P2RY12 для значений ADP-test1 и TRAP-test1, для полиморфного локуса T1565C гена ITGB3 для значений ADP-test2 и для полиморфного локуса T786C гена eNOS для значений ASPI-test1 (табл. 2).

Для дальнейшего анализа пациенты с ИМ были разделены на 4 подгруппы в зависимости от наличия ВОРТ к АСК, клопидогрелу, к обоим препаратам одновременно (см. табл. 1) или отсутствия ВОРТ. Изучалась частота встречаемости аллелей и генотипов исследуемых генов в данных подгруппах. В табл. 3 выделены только статистически значимые различия. Более высокая частота встречаемости аллеля 681A гена CYP2C19 выявлена у пациентов с ВОРТ к клопидогрелу исходно, на 12-14-е сутки ИМ и на 28-30-е сутки ИМ по сравнению с пациентами без ВОРТ. У пациентов с ВОРТ к клопидогрелу реже встречался генотип GG гена CYP2C19 исходно и на 28-30-е сутки ИМ, и чаще встречался генотип АА гена CYP2C19 исходно и на 28-30-е сутки имелась тенденция, по сравнению с пациентами без ВОРТ. Также выявлена более частая встречаемость локуса H2 гена P2RY12 у пациентов с ВОРТ к клопидогрелу на 1-2-е сутки ИМ, по сравнению с пациентами без ВОРТ и более частая встречаемость аллеля 786C гена eNOS3 у пациентов с ВОРТ к АСК на 1-2-е сутки ИМ по сравнению с пациентами без ВОРТ. У пациентов с ВОРТ к АСК реже встречался генотип ТТ гена eNOS3 на 1-2-е сутки ИМ, по сравнению с пациентами без ВОРТ.

У носителей аллеля 681A гена CYP2C19 риск развития ВОРТ к клопидогрелу выше, по сравнению с носителями аллеля G681 на протяжении всего периода наблюдения: на 1-2-е сутки ИМ ОШ 1,8 (1,14-2,88), р=0,012, на 12-14-е сутки ИМ ОШ 1,7 (1,08-2,68), р=0,023 и на 28-30-е сутки ИМ ОШ 2,3 (1,42-3,81), р=0,0008. У носителей генотипа АА гена CYP2C19 риск развития ВОРТ к клопидогрелу выше, по сравнению с носителями генотипа GG, исходно ОШ 6,5 (1,16-36,4), р=0,033, на 28-30-е сутки ИМ ОШ 7,8 (1,26-48,0), р=0,027.

У носителей локуса H2 гена P2RY12 риск развития ВОРТ к клопидогрелу выше, по сравнению с носителями локуса Н1 на 1-2-е сутки ИМ ОШ 1,5 (1,02-2,22), р=0,039.

У носителей аллеля 786C гена eNOS3 риск развития ВОРТ к АСК выше, по сравнению с носителями аллеля T786 на 1-2-е сутки ИМ ОШ 1,4 (1,02-1,96), р=0,036.

В результате анализа ассоциации полиморфизмов нами обнаружено мультигенное носительство минорных аллелей 2, 3 и более изучаемых полиморфизмов в гомо- и гетерозиготном состоянии: у 18 человек не было мутаций, у 76 человек встречалась одна мутация, у 147 — комбинация 2 мутаций, 109 — комбинация 3 мутаций, у 44 человек — комбинация 4 мутаций, у 6 человек — 5 мутаций. У пациентов с ВОРТ3 на 28-30-е сутки ИМ чаще встречались следующие гаплотипы минорных аллелей генов CYP2C19 + ITGA2 + P2RY12 + eNOS (у 7 человек с ВОРТ3 против 4 без ВОРТ, ТКФ=0,042) и генов CYP2C19 + ITGA2 + eNOS (у 11 человек с ВОРТ3 против 5 без ВОРТ, ТКФ=0,0022). По остальным гаплотипам минорных аллелей исследованных генов статистически значимых различий получено не было. У носителей гаплотипов минорных аллелей генов CYP2C19 + ITGA2 + P2RY12 + eNOS (ОШ 3,9 (1,13-13,65), р=0,032) и генов CYP2C19 + ITGA2 + eNOS (ОШ 5,1 (1,72-14,96), р=0,0032) риск развития ВОРТ к ДАТТ на 28-30-е сутки ИМ выше, по сравнению с остальной выборкой пациентов.

В нескольких исследованиях продемонстрирована ассоциация сниженной эффективности клопидогрела и носительства аллеля 681A гена CYP2C19 [5][6] и наши результаты согласуются с этими работами. Однако есть публикации, в которых взаимосвязь полиморфизма G681A гена CYP2C19 с ВОРТ на клопидогрел не выявлена [7][8]. Растет число статей, свидетельствующих о связи носительства 681A аллеля гена CYP2C19 с неблагоприятным прогнозом у пациентов с ИМ, перенесших ЧКВ и получавших клопидогрел, по сравнению с лицами, не являющимися носителями данного аллеля [9, 10]. С учетом редкого использования тикагрелора и прасугрела в Республике Беларусь, генотипирование пациентов с ИМ, имеющих ВОРТ на клопидогрел, может быть оправдано. При выявлении носительства 681A аллеля может быть рекомендована замена клопидогрела на блокаторы пуриновых рецепторов нового поколения, что уменьшит риск возникновения сердечно-сосудистых осложнений у данной категории пациентов. Данная схема находит подтверждение в фармакоэкономических исследованиях, так, по данным систематического обзора сделан вывод, что применение терапии, основанной на генотипировании CYP2C19, является экономически эффективным подходом при выборе антитромбоцитарных лекарственных средств у пациентов с ОКС, подвергающихся ЧКВ [11].

Литературные данные о влиянии полиморфизма Н1/Н2 гена P2RY12 на эффективность клопидогрела являются неоднозначными. Некоторые исследования подтверждают влияние полиморфизма P2RY12 на активацию тромбоцитов и эффективность клопидогрела у пациентов с ОКС [12][13], что согласуется с нашими данными, в то время как другие опровергают эти связи [14] или указывают на синергетический эффект с другими генетическими вариациями, такими как CYP2C19 и MDR1 [15][16]. Исследования по оценке влияния полиморфизма генов на спонтанную агрегацию тромбоцитов малочисленны. Есть работа, в которой у здоровых добровольцев демонстрируется связь между носителями генотипа H2/H2 гена P2RY12 и сниженной спонтанной агрегацией тромбоцитов, определяемой при помощи TRAP-test [17], тогда как наши данные демонстрируют противоположные эффекты. Более того, в исследованиях продемонстрировано, что полиморфизм генов может лишь частично объяснить вариабельность ответа на антитромбоцитарную терапию, некоторые клинические факторы, такие как курение, пол, возраст, воспаление и др. могут оказывать влияние не только на функциональную активность тромбоцитов [18][19], но и на влияние полиморфизма P2RY12 на течение ишемической болезни сердца [20], поэтому исчезновение ассоциации между полиморфизмом P2RY12 и агрегацией тромбоцитов на более поздних сроках ИМ в нашей работе может быть объяснено большим вкладом других факторов нежели полиморфизм генов.

Результаты исследований о влиянии аллеля 1565C гена ITGB3 на эффективность клопидогрела противоречивые. Есть работы с похожими на наши результатами, когда у пациентов были более высокие значения индуцированной агрегации тромбоцитов на разные стимулы, но не было разницы в распределении частот аллелей и генотипов в зависимости от наличия ВОРТ [21][22]. Есть работы, в которых выявлена ассоциация между носительством аллеля 1565C гена ITGB3 и повышенной спонтанной агрегацией тромбоцитов [23], пониженной чувствительностью как к АСК [24-26], так и к клопидогрелу [23][27]. Однако в большинстве работ сообщается об отсутствии связи между носительством данного аллеля и повышенной функцией тромбоцитов, а также развитием ВОРТ к АСК и клопидогрелу [28][29].

По данным литературы показана связь между носительством аллеля 807Т гена ITGA2 и нечувствительностью тромбоцитов к действию АСК [30][31], есть ряд работ, в которых такой связи обнаружено не было [32][33], что согласуется с нашими результатами. Более того, встречаются работы, в которых показано, что носительство аллеля 807T гена ITGA2 связано с уменьшением спонтанной агрегации тромбоцитов, выявляемой при помощи TRAP-test [34], что может быть обусловлено снижением перекрёстной активности PAR-рецепторов тромбоцитов.

Согласно публикациям, носители генотипа 786CC демонстрируют повышенную степень индуцированной агрегации тромбоцитов на фоне приема клопидогрела и препаратов АСК при стабильной ишемической болезни сердца [35]. Есть работы, показывающие подобные нашим результаты, где выявлена связь аллеля 786C гена e-NOS3 c ВОРТ на прием АСК у пациентов с ОКС [3]. Однако работы по данному вопросу малочисленны, и требуются дополнительные исследования.

Ограничения исследования

Исследование было одноцентровым, что могло оказать влияние на мощность полученных результатов.

У пациентов с ИМ выявлена ассоциация ВОРТ к клопидогрелу с полиморфизмом G681A гена CYP2C19 в течение всего периода наблюдения, с полиморфизмом H1/H2 гена P2RY12 в первые сутки ИМ, с полиморфизмом T1565C гена ITGB3 на 10-12-е сутки ИМ, и ассоциация ВОРТ к АСК с полиморфизмом T786C гена eNOS в первые сутки ИМ. Гаплотипы минорных аллелей генов CYP2C19 + ITGA2 + P2RY12 + eNOS и генов CYP2C19 + ITGA2 + eNOS ассоциировались с более высоким риском развития ВОРТ к ДАТТ на 28-30-е сутки ИМ. Носительство данных полиморфизмов может быть фактором риска развития тромботических осложнений у пациентов с ИМ ввиду снижения эффективности антитромбоцитарной терапии.

Отношения и Деятельность. Нет.

Relationships and Activities. None.

Финансирование. Исследование проведено при поддержке Гродненского государственного медицинского университета и ГНТП «Новые методы оказания медицинской помощи 2016-2020 годы», подпрограмма «Болезни системы кровообращения», договор 02.11/2017.

Funding. The study was supported by the Grodno State Medical University, SSTP “New methods of providing medical care 2016-2020”, subprogram “Diseases of the circulatorysystem”, agreement 02.11/2017.