Современная противоопухолевая терапия (ПОТ) претерпела сильные изменения: практикующие онкологи все больше прибегают к применению таргетных препаратов. Несмотря на это, высокая эффективность и доступность антрациклиновых антибиотиков обусловливает их широкое использование для лечения пациентов с верифицированными злокачественными новообразованиями [1]. Многолетний клинический опыт и понимание молекулярных механизмов действия антрациклинов не исключают проблему возникновения антрациклин-индуцированной кардиотоксичности (АИКТ), которая остаётся одной из основных причин ограничения дозы, преждевременного прекращения лечения и ухудшения качества жизни пациентов [2].

Патогенез сердечно-сосудистых нежелательных явлений, ассоциированных с применением антрациклинов, включает комплекс дополняющих друг друга процессов. В частности, доксорубицин индуцирует эндотелиальную дисфункцию посредством генерации реактивных форм кислорода через циклирование хинонового фрагмента и хелатирование железа с формированием высокотоксичных комплексов доксорубицин-железо [3]. Это приводит к митохондриальной дисфункции, активации апоптоза и снижению экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) с последующим уменьшением биодоступности оксида азота (NO). Возникающая эндотелиальная активация сопровождается повышением уровня адгезивных молекул (VCAM-1, ICAM-1), секрецией провоспалительных цитокинов (интерлейкина-6, фактора некроза опухоли-α) и нарушением целостности гликокаликса, что создаёт предпосылки для развития микроангиопатии и потенцирует сердечно-сосудистые осложнения [3]. Важно отметить, что схожие режимы терапии и суммарные дозы химиотерапевтических агентов не всегда гарантируют идентичные клинические проявления кардиоваскулярной токсичности (КВТ). Такая вариабельность нежелательных реакций на терапию указывает на важную роль генетических факторов в предрасположенности к ним [4]. При этом для оценки вклада в риск развития АИКТ однонуклеотидных вариантов (ОНВ) следует учитывать межгенное взаимодействие при носительстве различных аллельных вариантов. Развитие персонализированной медицины открывает возможности для предиктивного моделирования риска возникновения КВТ на основе генетического профиля пациента, что может стать основой для индивидуализации дозирования, выбора альтернативных схем терапии или раннего назначения кардиопротективных препаратов.

Цель исследования — выявить генетические варианты, ассоциированные с риском развития антрациклиновой КВТ на фоне ПОТ, у пациентов с фолликулярной лимфомой.

Выполнено открытое одноцентровое проспективное наблюдательное исследование. С января 2022 по сентябрь 2024 гг. отобрано 83 пациента с диагнозом неходжкинская В-клеточная фолликулярная лимфома, которым было показано проведение 6 курсов стандартной ПОТ по схеме R-CHOP с дозой антрациклинового антибиотика доксорубицина 50 мг/м² в/в капельно в день.

Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен комитетом по биоэтике при ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, выписка № 239 от 10.2021. Все пациенты до включения в исследование подписали добровольное информированное согласие на участие в нем.

Исследование проходило в 2 этапа: до лечения и после 6 курсов ПОТ (рис. 1). Период наблюдения составил 180±8 дней. Все участники исследования на этапе включения (визит 1) прошли опрос с целью выявления сердечно-сосудистого анамнеза и симптомов, типичных для сердечной недостаточности; физикальный осмотр; регистрацию электрокардиограммы; анализ крови на определение уровня холестерина, глюкозы, тропонина Т и N-концевого промозгового натрийуретического пептида (NT-proBNP); выполнение стандартной и спекл-трекинг эхокардиографии с оценкой фракции выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ) по методу Simpson и глобальной продольной деформации миокарда ЛЖ (Global Longitudinal Strain for Left Ventricle, GLS LV). Кроме того, всем пациентам проводилось однократно полноэкзомное секвенирование. Геномная ДНК была выделена из образцов цельной крови при помощи набора HiPure Blood DNA Mini Kit (Magen, Китай). Секвенирование образцов ДНК проводилось на платформе DNBSEQ-G400 (MGI, Китай) со средним покрытием >100х. После завершения химиотерапии (визит 2) пациенты прошли те же исследования, что на 1-м визите, за исключением генетического.

По результатам повторной стандартной и спекл-трекинг эхокардиографии, участники исследования были разделены на 2 группы: в основную вошли 34 пациента с КВТ (средний возраст 59,0 (51,5; 69,0) лет, из них мужчин 44,1% (n=15)), в контрольную — 49 пациентов без КВТ (средний возраст 55,0 (47,0; 66,5) лет, из них мужчин 55,1% (n=27)). Распределение пациентов по группам осуществлялось в соответствии с наличием или отсутствием критериев верифицированной КВТ: снижение ФВ ЛЖ более, чем на 10% от ее величины до лечения и/или снижение глобальной продольной деформации ЛЖ (Global Longitudinal Strain for Left Ventricle, GLS LV) на 15% и более от исходной ее величины и/или повышение уровня высокочувствительных тропонинов или натрийуретических пептидов [5].

Критерии включения: согласие пациента на участие в исследовании, подтвержденный диагноз неходжкинской В-клеточной фолликулярной лимфомы, наличие показаний к ПОТ, отсутствие отягощенного сердечно-сосудистого анамнеза или убедительных данных за сердечно-сосудистое заболевание, возраст старше 18 лет. Критерии невключения: дети, беременные женщины, наличие фибрилляции предсердий, отягощенный сердечно-сосудистый анамнез, отсутствие показаний к ПОТ. Критерии исключения: отказ пациента продолжить участие в исследовании или ситуация, при которой невозможно продолжить лечение по установленной схеме.

Нормальность распределения количественных показателей оценивали критерием Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса при выборке пациентов в количестве более 50 и критерием Шапиро–Уилка — менее 50. Количественные переменные с нормальным распределением представлены в виде среднеарифметического и стандартного отклонения (M±SD). При отсутствии нормальности распределения данные описывались в виде медианы (Ме) с интерквартильным размахом [Q1; Q3]. Категориальные показатели представлены в виде абсолютных значений (n) и процентных долей (%).

Обработку первичных данных секвенирования выполняли в GATK 4.6.1.0. В качестве референсного генома использовали GRCh37.p13. ОНВ с глубиной прочтения менее 70-х были исключены из анализа. Клиническая значимость ОНВ оценивалась на основе сведений из баз данных dbSNP, ClinVar, OMIM. В дальнейший анализ отобраны гены, связанные с известными механизмами развития АИКТ. Ассоциации выявленных ОНВ с риском развития АИК, наличие потенциальных гаплотипов и межгенного взаимодействия исследовали с помощью R 4.4.21. Наиболее перспективные группы ОНВ с потенциальным наличием межгенного взаимодействия дополнительно оценивали с использованием алгоритма снижения размерности многофакторного пространства (Multifactor Dimensionality Reduction, MDR), реализованного в MDR 3.0.2.

Оценку статистической значимости различий качественных переменных проводили с помощью таблиц сопряженности: если количество наблюдений в любой из ячеек было ≥10, использовался χ² Пирсона, если от 5 до 9 — поправка Йейтса на непрерывность, при количестве наблюдений <5 — точечный тест Фишера. Были рассчитаны отношения шансов (ОШ) и 95% доверительные интервалы (ДИ) для выявления ассоциаций между ОНВ и КВТ. Различия считали статистически значимыми при р <0,05.

Основная характеристика пациентов, включенных в исследование, представлена в таблице 1. Группы были сопоставимы по возрасту, полу, количеству трудоустроенных, получаемой схеме ПОТ. ИМТ среди больных с зафиксированной КВТ был значимо выше (р <0,001). В основной группе зафиксирован более продолжительный корригированный интервал QT (QTc), более высокий уровень глюкозы и более низкое значение GLS LV за весь период наблюдения. Значение тропонина Т оставалось в группах в пределах нормальных популяционных значений. Показатель общего холестерина и ФВ ЛЖ в основной группе не изменились. Уровень NT-proBNP после окончания курса ПОТ был статистически значимо выше у пациентов с КВТ (табл. 2). Выбывания участников из исследования не было.

Анализ ассоциаций выявил 54 ОНВ, значимо (p <0,05) сопряженных с риском развития АИКТ (табл. 3). В группе генов, связанных с метаболизмом или транспортом антрациклинов, определено 10 значимых ассоциаций ОНВ. Выявлено, что носительство минорных аллелей вариантов rs1128503, rs2235033 в гене ABCB1, rs212088, rs35604 в гене ABCC1, и rs3749442 в гене ABCC5 связано со снижением риска возникновения КВТ, а минорная аллель варианта rs246232 в гене ABCC1 — с повышением. Среди генов семейства SLC-транспортеров выявлена одна значимая ассоциация варианта rs61000762 в гене SLC39A13 со снижением риска развития АИКТ в 2,1 раза (ОR=0,48; 95% ДИ 0,17-1,35; p=0,045). Риск развития АИКТ снижался в 2,3-2,6 раза при носительстве минорного аллеля двух вариантов rs1056892 и rs2835286 в гене CBR3 (вариант rs1056892: ОШ 0,39; 95% ДИ 0,18-0,84; p=0,011; вариант rs2835286: ОШ=0,43; 95% ДИ 0,22-0,87; p=0,015). Среди генов, связанных с образованием и переносом активных форм кислорода, а также с антиоксидантной защитой выявлено 7 значимых ОНВ в генах NCF4, NOS3, POR. При этом, наименьшее значение ОR получено для варианта rs1549758 в гене NOS3, минорная аллель С имела ассоциацию со снижением риска развития АИКТ в 3,5 раза (ОШ=0,29; 95% ДИ 0,14-0,63; p=0,001). В генах CACNA1C, CACNA1D, CACNA2D1 и RYR2, связанных с дисрегуляцией внутриклеточных и митохондриальных кальций-зависимых сигнальных путей, выявлено 10 значимых ОНВ. В группе генов, связанных с дисфункцией саркомера, выявлено 25 значимых ОНВ в генах FHOD3, MYBPC3, MYH11, MYH6, MYL2, MYOM1, NEBL, PDLIM3, TTN. Наличие минорного аллеля 17 ОНВ связано со снижением риска развития АИКТ, 6 ОНВ — с увеличением риска.

В ходе анализа межгенных взаимодействий определены три гаплотипа ААССАС, GCCTGC и GCCTGT (rs1128503, rs2032582, rs2214102, rs2235013, rs2235033, rs4728699) гена ABCB1, наличие которых снижало вероятность развития АИКТ в 2,4-3,7 раз (ОШ 0,27; 95% ДИ 0,08-0,88; p=0,03; ОШ 0,41; 95% ДИ 0,17-0,99; p=0,048; ОШ 0,32; 95% ДИ 0,11-0,92; p=0,034). Также идентифицирован гаплотип ААС вариантов rs2072708, rs2072710 и rs2075939 в гене NCF4, при его носительстве вероятность развития АИКТ увеличивается в 9,7 раз (ОШ 9,7; 95% ДИ 1,9-50,1; p=0,006). Также выявлены аллельные сочетания AACCAA вариантов rs2072708, rs2072710, rs2075939, rs5756374, rs10491056 и rs11012353 в генах NCF4 и NEBL (ОШ 13,53; 95% ДИ 1,8-100,1; p=0,01) и GTCA вариантов rs1443638, rs2306422, rs72547284 и rs11661275 в генах CELF4, CYBA и FHOD3 (ОШ 10,2; 95% ДИ 2,12-48,9; p=0,006) связанные с увеличением риска развития АИКТ в 10,2-13,53 раза. Наименьшее значение отношения шансов наблюдалось у аллельного сочетания G(TC)GGGCG вариантов rs2233260, rs3833910, rs7232329, rs8096379, rs200571909, rs625223 и rs2566514 в генах MYL2, MYOM1, NEB и NOS3 (ОШ 0,27; 95% ДИ 0,08-0,88; p=0,03). В четырёх выявленных группах ОНВ дополнительно проведён анализ методом MDR, который показал, что все они характеризовались наличием эпистаза (p <0,0001) (рис. 2). Наиболее выраженные межгенные взаимодействия наблюдались в группе rs200571909, rs2233260, rs2566514, rs3833910, rs625223, rs7232329 и rs8096379, чувствительность составила 0,94, специфичность — 0,89, ОR — 124,0 (95% ДИ: 22,5-682,6).

Известно, что примерно 45% выявленных на сегодняшний день ОНВ, ассоциированных с АИКТ, расположены в генах, кодирующих ABC- и SLC-транспортеры. Наиболее изученными из них являются гены ABCB1, ABCC1, ABCB4 и SLC28A1 [6]. В настоящей работе выявлено, что носительство минорного аллеля А в гене SLC39A13 (rs61000762), минорных аллелей А (rs212088, rs35604) в гене ABCC1, аллелей С вариантов в гене ABCB1 (rs1128503, rs2235033) связано со снижением риска развития АИКТ. Также выявлен вариант rs246232 в гене ABCC1, носительство его минорного аллеля G ассоциировано с увеличением риска развития АИКТ.

Роль гена CBR3, кодирующего один из основных ферментов семейства карбонилредуктаз, метаболизирующих антрациклины, была изучена у детей с онкологическими заболеваниями. При этом вариант rs1056892 был связан с повышенным риском АИКТ [7-8]. В представленном исследовании варианты rs1056892 и rs2835286 в гене CBR3 были связаны со снижением риска развития АИКТ.

Существуют сведения о способности антрациклиновых антибиотиков вызывать избыточное образование активных форм кислорода вследствие связывания химиотерапевтического агента с редуктазным доменом eNOS [9]. В представленном исследовании было выявлено 4 варианта rs1549758, rs1799983, rs891512 и rs2566514 в гене NOS3, имеющих ассоциацию со снижением риска АИКТ. Ранее был описан протективный эффект вариантов rs1799983 и rs891512 гена NOS3 в отношении тромботических событий у детей с онкологическими заболеваниями [10] и у пациентов с ишемической болезнью сердца [11]. Также отмечалось, что наличие аллеля T в варианте rs1549758 ассоциировано с возникновением ишемической болезни сердца [12], а генотип TT варианта rs1799983 — с возникновением АИКТ у женщин [13]. Помимо NO-синтазы, с уровнем активных форм кислорода при антрациклиновой терапии связана работа фермента, кодируемого геном POR [14]. В представленном исследовании был выявлен вариант rs10954724 в гене POR, значимо ассоциированный с возникновением АИКТ.

Еще одним из предполагаемых механизмов АИКТ считается дисрегуляция внутриклеточных и митохондриальных кальций-зависимых сигнальных путей [15]. В настоящей работе обнаружено несколько значимых ОНВ в генах семейства потенциал-зависимых кальциевых каналов CACNA и гене RYR2.

Наличие ОНВ в генах, кодирующих белки, из которых состоят саркомеры, также способствуют развитию АИКТ [3]. В работе 2019 г. описано, что вариации в гене TTN, были связаны с высоким риском развития антрациклиновой кардиомиопатии [16]. В ходе настоящей работы определено 12 ОНВ, носительство которых снижает риск развития АИКТ в 1,4-1,7 раза. Стоит отметить и наличие ассоциаций 7 ОНВ в генах белков актин-миозиновой системы, характерной для кардиомиоцитов: FHOD3, MYBPC3, MYH6, MYL2, NEBL. Так же были обнаружены 4 ОНВ, ассоциированные с возникновением АИКТ, в генах компонентов общих сократительных структур: MYH11, MYOM1, PDLIM3. Полиморфизмы этих генов являются предикторами гипертрофической кардиомиопатии [17].

Учитывая различные механизмы возникновения АИКТ, при оценке индивидуального риска необходимо рассматривать возможное синергичное или антагонистическое влияние аллельных сочетаний генов. В настоящей работе были выявлены гаплотипы и ААССАС, GCCTGC и GCCTGT в гене ABCB1, ААС в гене NCF4, а аллельное сочетание G(TC)GGGCG MYL2 в генах MYOM1, NEB и NOS3, связанные со снижением либо с увеличением риска развития АИКТ. Полученные сочетания аллелей могут свидетельствовать о межгенном взаимодействии. Схожие эффекты носительства гаплотипов гена NCF4 отмечены в работе Ю.Е. Азаровой и соавт. [18]. Будущие исследования должны подтвердить их вклад в риск развития и построение моделей прогнозирования АИКТ.

Одноцентровый тип настоящего исследования ограничивает возможность обобщения (экстраполяции) полученных результатов. Кроме того, небольшой размер выборки, связанный с отбором целевых пациентов по критериям включения/невключения, снижает статистическую мощность и надежность результатов исследования.

В представленном исследовании выявлены генетические полиморфизмы, реализующие токсический эффект в отношении функции миокарда ЛЖ. Анализ полученных результатов позволил определить варианты генов, способных повышать риски наступления АИКТ на фоне ПОТ у пациентов с фолликулярной лимфомой.

Изучение генома пациента до проведения химиотерапии может предсказать наличие генных вариантов нежелательных явлений этой терапии и открыть возможности для назначения профилактических мероприятий. Необходимы дальнейшие крупные исследования, которые смогли бы обеспечить устранение или, по меньшей мере, ограничение непреднамеренных последствий жизненно важной терапии злокачественных новообразований.

Отношения и Деятельность. Нет.

Relationships and Activities. None.

1. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, https://www.scirp.org/reference/referencespapers?referenceid=3131254.