Оценка маркеров фиброза, как потенциального метода диагностики необструктивного поражения коронарных артерий у больных стабильной ишемической болезнью сердца

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются одной из основных причин смертности во всем мире [1]. Распространенность ишемической болезни сердца (ИБС), значительные экономические затраты и связанный с этим риск инвазивных вмешательств требуют разработки новых алгоритмов ее диагностики и лечения.

Проект «Геном человека», завершившийся в 2003 г., позволил по новому взглянуть на патогенез заболеваний [2]. Так, полногеномные ассоциативные исследования (GWAS) выявили связь между ИБС и полиморфизмами генов, кодирующих сигнальный путь трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) [3]. Сбой передачи сигнала в этом сигнальном пути типичен для многих заболеваний человека. Все этапы и задействованные биомолекулы хорошо изучены, однако до сих пор неясно, что вызывает различные многочисленные биологические эффекты при его активации [4].

TGF-β1 – один из 33 известных полипептидов семейства TGF-β человека [5]. Белки семейства TGF-β играют важную роль в контроле пролиферации и дифференцировки клеток, заживлении ран и активации иммунной системы, а также участвуют в патофизиологии ССЗ и злокачественных новообразований. Одним из активаторов TGF-β1 является металлопротеиназа 9 [6]. В настоящее время выявлена ассоциация между сигнальным путем TGF-β и интерлейкином-6 (ИЛ-6). Так, ИЛ-6 активирует продукцию белков TGF-β сердечными фибробластами [7], процессы фиброгенеза и в конечном итоге приводит к ремоделированию сердца [8].

Наименее изученными являются больные с необструктивным поражением коронарных артерий (ноИБС), у которых имеются типичная стенокардия, инструментально верифицированные признаки ишемии миокарда (стресс-эхокардиография, сцинтиграфия миокарда и стресс-магнитно-резонансная томография) и отсутствуют гемодинамически значимые стенозы (стеноз<50%) коронарных артерий (КА). По результатам коронароангиографии (КАГ) в эту категорию относят пациентов с интактными КА (стеноз отсутствует), легкими (<30%) и умеренными (≥30% и <50%) атеросклеротическими поражениями. Распространенность ноИБС может достигать 20% при остром и 50% при хроническом коронарных синдромах [9]. Хотя у этих пациентов нет значимого атеросклероза КА, у них также развиваются неблагоприятные сердечнососудистые события, в частности, инфаркт миокарда (ИМ) без обструкции КА (ИМбоКА). Частота ИМбоКА у пациентов с этой формой ИБС колеблется от 2,2 до 21,8% [10]. Как правило, ИМбоКА возникает преимущественно у пациентов женского пола, более молодого возраста, с меньшей вероятностью выявления сахарного диабета, артериальной гипертензии, дислипидемии, что свидетельствует о ведущей роли в патогенезе неатеросклеротических поражения КА таких факторов, как инсулинорезистентность, воспаление и психосоциальные аспекты [11].

Цель исследования – изучить уровни маркеров фиброза у пациентов со стабильной ИБС и различными вариантами поражения КА (обструктивное и необструктивное), а также выявить возможные различия для диагностики степени обструкции коронарного русла.

Материал и методы

Проводимое обсервационное исследование одобрено локальным этическим комитетом в соответствии с Хельсинкской декларацией. В исследовании участвовало три группы: больные с необструктивной ИБС составили основную группу (n=20), с обструктивной ИБС – группу сравнения (n=20), и здоровые добровольцы – контрольную группу (n=40). Критерии включения в основную группу: инструментально подтвержденная ишемия миокарда, отсутствие выраженного стеноза КА (<50%) по данным КАГ, отсутствие реваскуляризации миокарда в анамнезе (шунтирование КА, баллонная ангиопластика и/или стентирование КА). В группу сравнения вошли пациенты с обструктивной ИБС по результатам КАГ и реваскуляризацией миокарда (в анамнезе у 50% из них). Критерии исключения: острый коронарный синдром, хроническая сердечная недостаточность (III-IV ФК по NYHA), гемодинамически значимые пороки сердца, инсульт в течение 6 мес, предшествующих исследованию, хроническая болезнь почек со скоростью клубочковой фильтрации <30 мл/мин, заболевания перикарда, аутоиммунные и онкологические заболевания. В контрольную группу вошли здоровые добровольцы без хронических заболеваний (рис. 1). Клинико-демографические данные представлены в табл. 1.

Всем больным проводилось стандартное лабораторно-инструментальное обследование: клинический анализ крови (гематологический анализатор XP 300, производителя Sysmex®), биохимический анализ крови [общий холестерин (ОХС), липопротеины низкой (ЛНП) и высокой плотности (ЛВП) колориметрическим методом, с помощью реагентов ADVIA® Chemistry Cholesterol Reagent, ADVIA® Chemistry Direct LDL Cholesterol Reagents, ADVIA® Chemistry Direct HDL Cholesterol Reagents, мочевая кислота (колориметрическим методом, с помощью реагента ADVIA® Chemistry Uric Acid Reagents), креатинин (кинетическим методом (метод Яффе) с помощью реагента ADVIA® Chemistry Creatinine Reagents), глюкоза венозной плазмы натощак (гексокиназным методом с помощью реагента ADVIA® Chemistry Glucose Hexokinase II Reagents)], суточное мониторирование артериального давления (БиПиЛАБ, Россия), холтеровское мониторирование (medilogAR®, Shiller, Швейцария), Эхокардиография (Vivid 7, GE Healthcare, США), рентгеновское исследование органов грудной клетки (УнивеРС-МТ, Россия), велоэргометрия (ERG 911 S/L, Shiller, Швейцария) и КАГ (Siemens Artis Zee, производитель Siemens Healthineers GmbH, Германия). Все диагнозы установлены на основании актуальных российских рекомендаций с учетом данных анамнеза пациентов. Участники контрольной группы медикаментозную терапию не получали, поэтому уровни общего холестерина значимо различались между больными с ИБС и группой контроля (табл. 2).

Образцы крови после центрифугирования были заморожены в криопробирках при температуре -80°C. Для оценки уровней TGF-β1 и MMP-9 использовали иммуноферментный анализ (ИФА) (набор реагентов для иммуноферментного анализа TGF-β1 человека BMS249-4: Invitrogen, США; коэффициент вариации 4,9% и 3,2%; MMP9 Human ELISA Kit, Invitrogen, США, коэффициент вариации 10,2% и 7,3%).

Для дополнительной оценки степени выраженности фиброза проводилось определение типа ремоделирования миокарда. По результатам эхокардиографии все пациенты, включенные в исследование, были разделены на четыре группы по типу ремоделирования миокарда [12] с учетом индекса массы миокарда левого желудочка (ЛЖ) и относительной толщины его стенки. В зависимости от результатов расчетов были сформированы следующие группы пациентов: пациенты с нормальной геометрией сердца, концентрическим ремоделированием, концентрической и эксцентрической гипертрофией ЛЖ.

Статистический анализ проводился с помощью SPSS 23 (IBM, США). Для оценки значимости различий полученных данных был проведен апостериорный анализ с использованием программы G*Powerver 3.1.9.6 (Германия) [13]. Нормальное распределение количественных параметров оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка (n<50) или Колмогорова-Смирнова (n>50). В случае ненормального распределения мы описывали данные с использованием медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (25%; 75%). Категориальные данные были описаны с абсолютными значениями и процентами. Две группы сравнивали по количественному показателю с ненормальным распределением с помощью U-критерия Манна-Уитни. Три и более группы сравнивали по количественному показателю с ненормальным распределением с помощью теста Краскела-Уоллиса; апостериорные сравнения были сделаны с помощью критерия Данна, с поправкой Бонферрони. Процентные значения сравнивались при анализе кросс-таблиц по нескольким полям с использованием критерия хи-квадрат Пирсона. Диагностическую значимость количественных признаков в прогнозе исхода определяли с помощью анализа ROC-кривой. Точка отсечки в разделяющем значении качественного признака рассчитывалась по наибольшему значению индекса Юдена.

Результаты

Результаты ИФА показали, что уровни TGF-β1 были значимо выше у больных с обструктивной ИБС (р=0,008), нежели у больных с необструктивной ИБС и контрольной группой (р<0,001). Значимых различий между основной и контрольной группами не выявлено (рис. 2).

Построенная ROC-кривая отображает вероятность наличия необструктивной ИБС среди пациентов с верифицированной ИБС в зависимости от уровня TGF-β1 (рис. 3). Площадь под ROC-кривой составила 0,753±0,078 при 95% доверительном интервале 0,599-0,906. Модель статистически значима (р=0,007). Пороговое значение уровня TGF-β1, соответствующее максимальному значению индекса Юдена, составило 20269 пг/мл. Необструктивная ИБС прогнозировалась, когда уровень TGF-β1 был ниже или равен этому значению. Чувствительность и специфичность модели составили 89,5% и 70,0% соответственно.

Также сравнивали уровни TGF-β1 в зависимости от типа ремоделирования левого желудочка. Значимых различий (р=0,069) между группами выявлено не было, но следует подчеркнуть, что у пациентов с нормальной геометрией левого желудочка уровень TGFβ1 был минимальным. Необходимо отметить, что больных с эксцентрической гипертрофией в основной группе (с необструктивной ИБС) не было. Кроме того, в этой группе было больше пациентов с нормальной геометрией сердца, чем в группе сравнения (с обструктивной ИБС) (рис. 4).

Различались и уровни ММП-9, у пациентов с обструктивной ИБС он был максимальным, основная группа значимо отличалась от группы сравнения и контроля (рис. 5)

Зависимость уровня ММР-9 от TGF-β1 (рис. 6) оценивали методом линейной регрессии, учитывались такие показатели, как пол, возраст и ИМТ. Полученная регрессионная модель характеризовалась коэффициентом корреляции r=0,719, что соответствует высокой корреляции по шкале Чеддока. Модель была статистически значимой (p<0,001).

Обсуждение

Имеются противоречивые данные об уровне белков, участвующих в сигнальном пути TGF-β у пациентов с обструктивной ИБС [14-16]. Изучение пенистых клеток в атеросклеротических бляшках у больных атеросклерозом свидетельствует об активации этого сигнального пути и повышении экспрессии белка TGF-β1 макрофагами в стенке артерий [17]. С другой стороны, имеются данные и о защитном действии TGF-β1 [18,19], поскольку эффекты активации сигнального пути TGFβ зависят от типа клеток и стадии атеросклероза [3]. Кардиопротекция может быть обеспечена ингибированием фактора некроза опухоли-α и активных форм кислорода [20].

ММР-9 был выбран в качестве одного из активаторов TGF-β. Уровни ММР-9 у здоровых добровольцев и пациентов с необструктивной ИБС различались, что также могло косвенно свидетельствовать об активации TGF-β1 в стенках КА. Анализ представленной ROCкривой был использован для оценки вероятности наличия гемодинамически незначимого стеноза у больных с верифицированной ИБС по уровням активации процессов фиброза и ремоделирования миокарда за счет повышения концентрации TGF-β1. Однако эта модель не включает такие факторы, как пол, возраст и сопутствующие заболевания. TGF-β1 является одним из основных стимуляторов процесса развития фиброза тканей [21], его экспрессия приводит к гипертрофии и ремоделированию сердца [22]. Анализ зависимости между данными эхокардиографии и биологическими маркерами показал наиболее высокие уровни TGFβ1 и MMP-9 у больных с эксцентрической гипертрофией миокарда ЛЖ. Этот тип ремоделирования наблюдался только у больных с гемодинамически значимым стенозом КА. Эксцентрическая гипертрофия ЛЖ возникает в результате перегрузки давлением и ишемии миокарда, что объясняет высокие уровни TGF-β1 в группе с обструкцией коронарного русла [23], это может быть обусловлено активацией сигнального пути TGF-β [24,25].

Полученные данные могут свидетельствовать об активации TGF-β1 и MMP-9 у пациентов с обструктивной ИБС, что указывает на активацию процессов фиброза. В основной группе таких изменений не выявлено, учитывая различия в уровнях биомаркеров, вероятнее всего, изменения в сосудистой стенке у пациентов с необструктивным поражением КА начинаются с активации воспаления. Теория воспаления в патогенезе ССЗ обсуждается уже много лет. Ежегодно проводятся масштабные исследования, подтверждающие гипотезу о роли воспаления в патогенезе ИБС. В исследовании CANTOS (Canakinumab Antiinflammatory Thrombosis Outcomes Study) показано, что интерлейкины (в частности, интерлейкин-1β) играют важную роль в патогенезе ИБС [26]. Исследования с колхицином COLCOT (Colchicine Cardiovascular Outcomes Trial) и LoDoCo 2 (Low Dose Colchicine 2) также подтверждают воспалительную теорию атеросклероза [27]. На животных моделях необструктивной ИБС описана активация высвобождения лептина, резистина, ИЛ-6 и фактора некроза опухоли-α [28]. Таким образом, предполагается, что необходимы лизаты тканей КА для верификации наличия воспаления в стенках сосудов у больных с ИБС и гемодинамически незначимым стенозом, что требует проведения инвазивных процедур. Применение нового метода – коронарной компьютерной томографической ангиографии (ККА) у больных с гемодинамически незначимым стенозом позволило визуализировать воспаление в стенках эпикардиальных артерий сердца путем анализа измененного сигнала от периваскулярной жировой ткани [29].

Ограничения исследования. Исследование имеет некоторые ограничения. Во-первых, для более точных выводов требуется больше пациентов с необструктивной ИБС. Во-вторых, достаточно сложно подобрать однородные по возрасту группы контроля и пациентов. В российской популяции трудно найти здоровых лиц без сердечно-сосудистых заболеваний сопоставимого возраста с пациентами. Кроме того, на уровень TGFβ1 в группе больных ИБС может влиять артериальная гипертензия и гипертрофическое ремоделирование, вызванное перегрузкой объемом.

Заключение

В исследовании представлены данные об уровне TGF-β1 и ММР-9 у пациентов с обструктивной и необструктивной формами ИБС. Выявлены значимые различия между исследуемой группой (ноИБС) и группой сравнения (обструктивной ИБС), однако различия со здоровыми добровольцами обнаружены только для ММР-9. TGF-β1 и ММР-9 ассоциированы с коронарным атеросклерозом. Матриксные металлопротеиназы в будущем могут стать терапевтической мишенью, а также биомаркером в диагностике ИБС. В настоящее время применяют препараты с механизмом действия, основанным на ингибировании TGF-β. Вероятно, в будущем разработают новые препараты, блокирующие этот сигнальный путь, которые будут рекомендованы пациентам с различными типами ИБС.

Отношения и Деятельность. Нет.

Relationships and Activities. None.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда в виде научного проекта № 22-15-00424, научного гранта «Роль активации сигнального каскада WNT, процессов его эпигенетической регуляции и иммуноопосредованного воспаления в прогрессировании атеросклероза и возможности влияния на него методом терапевтического неоангиогенеза у пациентов со стабильной ишемической болезнью сердца».

Funding. The study was financially supported by the Russian Science Foundation in the form of scientific project No. 22-15-00424, scientific grant "The role of activation of the WNT signaling cascade, the processes of its epigenetic regulation and immune-mediated inflammation in the progression of atherosclerosis and the possibility of influencing it by therapeutic neoangiogenesis in patients with stable ischemic heart disease."