Влияние полиморфизмов генов CYP3A4/5, ABCB1 на остаточную равновесную концентрацию апиксабана и развитие кровотечений у пациентов с неклапанной фибрилляцией предсердий и тромбозом глубоких вен

Введение

С момента своего появления в клинической практике прямые пероральные антикоагулянты (ПОАК), способные блокировать отдельные и специфические этапы коагуляционного каскада, в частности тромбин (фактор IIa) или фактор Стюарта (Ха), в значительной степени заменили варфарин в качестве основного перорального антикоагулянта для предотвращения тромбоэмболических осложнений [1]. Хотя варфарин остается самым часто применяемым пероральным антикоагулянтом, объемы его назначений сократились более чем на 50% (с ~30 млн в 2011 г. до 14,6 млн в 2019 г.) [2]. Эта ситуация во многом обусловлена ростом использования ривароксабана (8,7 млн в 2019 г.) и апиксабана (14 млн в 2019 г.) и ожидается, что эта тенденция сохранится, так как по сравнению с варфарином ПОАК имеют множество преимуществ, включая быстрое начало действия, отсутствие взаимодействий с пищей, меньшее количество лекарственных взаимодействий, предсказуемую фармакокинетику и фармакодинамику [2-4].

Кроме того, завершенные рандомизированные исследования III фазы у пациентов с неклапанной фибрилляцией предсердий (ФП), тромбозом глубоких вен (ТГВ) и легочной эмболией показали, что ПОАК были столь же эффективными, а в некоторых случаях и превосходили варфарин по общему профилю безопасности, постоянно снижая частоту клинически значимых кровотечений [5-7]. Последующий метаанализ подтвердил эти выводы и показал, что ПОАК ассоциируются со значительным общим относительным снижением риска крупных кровотечений на 39% [8]. Но несмотря на многочисленные преимущества, кровотечения и тромбоэмболические события остаются серьезной проблемой при использовании ПОАК [9, 10]. К примеру, риск больших кровотечений во время лечения ПОАК оценивается в 2-3% в год, риск внутричерепного кровоизлияния оценивается примерно в 0,1-0,5% в год, а риск большого желудочно-кишечного кровотечения в 1-1,5% [11].

В основном апиксабан метаболизируется до неактивных метаболитов семейством цитохромов P450 в печени CYP3A4/5, с незначительным вкладом других изоферментов CYP1A2, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19 и CYP2J2 [12]. Кроме того все, ПОАК в том числе и апиксабан, являются субстратами P-гликопротеина (кодируется геном ABCB1) [13]. Этот мембранный белок транспортирует многие лекарственные средства [14]. Следовательно, генетические полиморфизмы CYP3A4/5, CYP2J2, ABCB1 и ABCG2 могут влиять на функционирование этих изоферментов и изменять фармакокинетику апиксабана, что влияет на безопасность и эффективность антикоагулянтной терапии [11].

Например, одно исследование выявило связь между интронным вариантом rs4148738 гена ABCB1, кодирующим P-gp, и увеличением пиковой концентрации апиксабана [15]. В другом исследовании варианты 1236C>T (rs1128503), 2677G>T (rs2032582) и 3435C>T (rs1045642) гена ABCB1 не влияли на соотношение концентрация/доза апиксабана [16]. Что касается CYP3A, то носительство генотипов CYP3A5*1/*3 или *3/*3 ассоциировалось с увеличением соотношения концентрация/доза апиксабана по сравнению с CYP3A5*1/*1 [16][17].

На сегодняшний день недостаточно исследований, посвященных изучению влияния этих полиморфных вариантов на эффективность или безопасность терапии апиксабаном, к тому результаты этих исследований довольно противоречивы [18].

Необходимо дополнительно изучить влияние генетических факторов на фармакокинетику апиксабана для более эффективной и безопасной антикоагулянтной терапии на основе такой клинико-фармакологической технологии персонализированной медицины, как фармакогенетическое тестирование. Поэтому целью нашего исследования стало изучение влияния полиморфных маркеров генов CYP3A4*22 (c.522-191C>T, rs35599367), CYP3A5*3 (c.219-237A>G, rs776746), ABCB1 rs1045642 (c.3435T>C) и rs4148738 (c.2692-2236C>T) на плазменную концентрацию апиксабана, на изменение протромбинового времени (ПВ), активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и развитие кровотечений у пациентов, принимающих апиксабан.

Материал и методы

Дизайн исследования и популяция пациентов

В открытое проспективное обсервационное исследование было включено 108 пациентов, получающих апиксабан в терапевтических дозах с неклапанной ФП и ТГВ. В исследовании принимали участие пациенты, госпитализированные в ГКБ им. С. С. Юдина и ГКБ им. С. П. Боткина. Критерии включения: подтверждённый диагноз неклапанной ФП (отсутствие искусственных клапанов сердца); подтверждённый диагноз ТГВ; подтверждённый диагноз тромбоэмболии лёгочной артерии и приём апиксабана в рекомендованных дозах. Критериями невключения были: повышенная чувствительность к апиксабану или вспомогательным компонентам препарата; подтверждённый диагноз клапанной ФП (наличие искусственных клапанов сердца или митрального стеноза); нарушение функции почек с клиренсом креатинина менее 15 мл/мин или процедура диализа; тяжёлая печеночная недостаточность класс В, С по Чайлд-Пью; геморрагический синдром, активное внутреннее кровотечение, внутричерепное кровоизлияние; врождённый дефицит лактазы, непереносимость лактозы, глюкозо-галактозная мальабсорбция; возраст до 18 лет; беременность или период грудного вскармливания. Все пациенты получали апиксабан (в дозах 2,5 мг 2 раза в сутки, 5 мг 2 раза в сутки, 10 мг 2 раза в сутки) в соответствии с инструкцией по применению препарата. Информированное согласие было получено от всех участников, включенных в исследование. Исследование было одобрено заседанием локального этического комитета ФГБОУ ДПО РМАНПО Российской медицинской академией непрерывного профессионального образования Минздрава России (Протокол № 12 от 20 октября 2021 г.) и проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Определение концентрации апиксабана в плазме

Для определения концентрации препарата выполнялось взятие венозной крови в вакуумные пробирки с антикоагулянтом ЭДТА-К3 Improvacuter (Guangzhou Improve Medical Instruments Co.Ltd, Китай) емкостью 6 мл на 4-7 сутки приема апиксабана. С целью получения плазмы образцы крови центрифугировались при 3000 об./мин в течении 15 минут. Выделенная плазма аликвотировалась в пробирки типа "Эппендорф" и замораживалась при температуре -70 °C до момента проведения анализа.

Концентрацию апиксабана в плазме определяли методом хроматографии с масс-спектрометрической детекцией на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent G1978B Multimode Sourse for 6410 Triple Quade LC/MS (Agilent Technologies, Inc., USA, 2008).

Количественное определение апиксабана в образцах плазмы крови человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии — тандемной масс-спектрометрии основано на извлечении аналита из плазмы путем осаждения белков плазмы крови ацетонитрилом с последующим их определением с помощью ВЭЖХ-МС/МС системы. Поскольку суточная доза апиксабана была различной (5, 10 и 20 мг в сутки), остаточная равновесная концентрация (Сmin,ss) апиксабана была скорректирована относительно суточной дозы лекарственного средства (Сmin,ss/D).

Определение полиморфизмов генов

На базе научно-исследовательского института молекулярной и персонализированной медицины ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России проводилось выделение ДНК из цельной венозной крови с помощью набора реагентов "S-Сорб" (ООО "Синтол", Россия).

Затем, методом полимеразной цепной реакции в реальном времени на ДНК-амплификаторе CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Inc.; USA), с использованием коммерческих наборов реактивов ("Синтол", Россия; "Thermo Fisher Scientific", США) производилось генотипирование полиморфизмов CYP3A4*22 (rs35599367) C>T, CYP3A5*3 A>G, ABCB1 (rs4148738) C>T, ABCB1 (rs1045642) C>T. Для отбора генов-кандидатов в исследование использовали данные по фармакокинетике и фармакодинамике из инструкции по применению препарата и базы данных PharmGKB¹.

Определение ПВ и АЧТВ

Оценка фармакодинамики апиксабана производилась посредством определения ПВ и АЧТВ. Взятие венозной крови осуществлялось перед очередным приёмом апиксабана на 4-7 сутки от начала приёма препарата с использованием вакуумных пробирок VACUTEST® (KIMA, Италия) c K₃ЭДТА. Показатели ПВ и АЧТВ определялись с помощью автоматического анализатора-коагулометра Destiny Max (Tcoag, Ирландия).

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка проводилась с помощью пакета программ SPSS Statistics 20.0. Характер распределения данных оценивали с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для сравнения количественных переменных между группами применялись непараметрические критерии (Манна-Уитни, Крускала-Уоллеса). Средние значения представлены в результатах как медиана и квартили — Me [Q1; Q3]. Частоту категориальных переменных сравнивали между собой при помощи критерия Хи-квадрат Пирсона или точного критерия Фишера. Для коррекции множественных сравнений вводилась поправка Бонферрони. Расчет соответствия распределения генотипов закону Харди-Вайнберга был выполнен при помощи онлайн-калькулятора [19]. Результаты с p<0,05 считали статистически значимыми.

Результаты

Общая характеристика пациентов, включенных в исследование, представлена в табл. 1. Количество пациентов мужского пола составило 51,9%, а медиана возраста — 70,0 [ 60;79] лет. Число пациентов, принимающих апиксабан в дозе 2,5 мг 2 раза в сутки составило 13,9%, а в дозе 5 мг 2 раза в сутки и 10 мг 2 раза в сутки — 43,5% и 42,6% соответственно.

Распределение частот аллелей трех генов соответствовало равновесию Харди-Вайнберга при значении р>0,05 (табл. 2).

При оценке сопоставимости сравниваемых групп пациентов, статистически значимые различия по клиническим и лабораторным факторам, которые могли повлиять на основные и вторичные исходы, были получены для пациентов с ABCB1 (rs4148738) C>T, которые являлись носителями аллельного варианта CС, у них исходно был выше уровень гемоглобина, по сравнению с пациентами носителями генотипа СT (134 [ 123;154] против 130 [ 117;145]) p=0,046. Также у пациентов с аллельным вариантом TT по полиморфному маркеру ABCB1 (rs4148738) C>T в 3 раза реже встречалась анемия 22,5% против 70,0% p=0,007. Пациенты с генотипом CC ABCB1 (rs1045642) C>T имели исходно более высокий уровень тромбоцитов (247 [ 228;291] против 197 [ 165;239]) p=0,030, а также в два раза чаще в анамнезе имели острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК)/транзиторную ишемическую атаку 25,0% против 50,0% p=0,032.

Влияние полиморфизма генов на концентрацию в плазме

Всего в этом исследовании было исследовано 4 однонуклеотидных полиморфизма (SNP), включая ABCB1 (2 SNP), CYP3A4/5 (2 SNP). При анализе Краскела-Уоллиса была обнаружена ассоциация между носительством генотипа ABCB1 (rs4148738) C>T и Сmin,ss /D апиксабана p=0,018 (табл. 3). У пациентов с генотипом СТ ABCB1 (rs4148738) C>T значение Сmin,ss /D, было выше, чем у пациентов с генотипом TT (6,23 [ 4;13] против 5,77 [ 4;17]). Не было установлено, что полиморфизмы генов CYP3A4*22 (rs35599367) C>T, CYP3A5*3 A>G, ABCB1 (rs1045642) C>T оказывают значимое влияние на Сmin,ss /D апиксабана (см. табл. 3).

Влияние полиморфизма генов на значения АЧТВ и ПВ

Пациенты с полиморфизмом гена CYP3A4*22 (rs35599367) C>T были разделены на две группы: СС n=8 (95,4%) и СТ n=17 (4,6%), носителей ТТ в выборке обнаружено не было. При анализе Манна-Уитни не было обнаружено статистически значимых ассоциаций между носительством полиморфизма и значениями АЧТВ и ПВ (табл. 4).

Пациенты с полиморфизмом гена CYP3A5*3 A>G также были разделены на две группы: AG n=8 (9,3%) и GG n=17 (90,7%). В данном случае при анализе не было обнаружено статистически значимых ассоциаций между носительством полиморфизма и значениями АЧТВ и ПВ (см. табл. 4).

Пациенты с полиморфизмами генов ABCB1 (rs1045738) C>T и ABCB1 (rs1045642) C>T были разделены на три группы. У носителей генотипа TT ABCB1 (rs1045642) C>T значение ПВ была статистически значимо выше, чем у генотипа CT (17,0 [ 40;112] против 14,9 [ 35;132]) p=0,044 (см. табл. 4). При этом не было обнаружено статистически значимых ассоциаций между носительством полиморфизма ABCB1 (rs4148738) C>T и значениями АЧТВ и ПВ (см. табл. 4).

Влияние полиморфизмов генов на возникновение кровотечений у пациентов с ФП и ТГВ

За время наблюдения в общей сложности было зафиксировано 36 геморрагических событий. Все кровотечения были неспровоцированными. Наиболее часто у пациентов регистрировалась гематурия (61%). Структура геморрагических осложнений представлена на рис. 1.

Нами были проанализированы пациенты с геморрагическими событиями на предмет носительства полиморфизмов генов CYP3A4/5 и ABCB1. Статистически значимого влияния носительства полиморфизмов rs35599367, rs776746, rs4148738 и rs4148642 вышеуказанных генов на риск развития геморрагических осложнений выявлено не было (табл. 5).

Обсуждение

Персонализация терапии ПОАК, в том числе апиксабаном, является ведущей задачей для обеспечения эффективности и безопасности применения этих препаратов [20]. Важную роль в вариабельности фармакокинетики играют полиморфизмы генов ферментов биотрансформации (СУР3А4/5) а также белков-переносчиков (P-gp) [21].

Ген ABCB1 кодирует эффлюксный насос P-gp, а все ПОАК являются субстратами P-gp. Поэтому ABCB1 является наиболее часто исследуемым геном для оценки взаимосвязи носительства конкретных аллельных вариантов с риском нежелательных лекарственных реакций на фоне терапии ПОАК, и прежде всего — кровотечений [2]. Предыдущие небольшие исследования показали, что минорный аллель ABCB1 rs4148738 был связан с более низкими пиковыми концентрациями апиксабана и более низким риском кровотечений у пациентов, получающих антикоагулянтную терапию апиксабаном [15][22][23]. Однако, эти результаты не подтвердились в более крупном исследовании, в котором проанализировали данные пациентов, участвовавших в третьей фазе крупного клинического исследования апиксабана [11]. В нашем исследовании обнаружено, что у пациентов с генотипом СТ ABCB1 (rs4148738) C>T значение Сmin,ss /D, было выше, чем у пациентов носителей гомозиготы TT, что скорее похоже на результаты, полученные C. Dimatteo и соавт. [15].

Из полиморфизмов генов, кодирующих ферменты биотрансформации CYP3A4/5, наиболее изучена роль нефункционального аллеля G (rs776746) гена CYP3A5. В то же время у гетерозиготных носителей (генотип AG) метаболизм апиксабана умеренно снижен из-за носительства одного нефункционального аллеля G, а у гетерозиготных носителей (CYP3A5 * 3, генотип GG) изофермент CYP3A5 не экспрессируется. Это является фактором риска развития нежелательных реакций (в частности, кровотечений) при приеме апиксабана [16]. S. Ueshima и соавт. обнаружили, что пациенты с ФП и гомозиготным генотипом TT (rs77674) гена CYP3A5 могли иметь пониженные концентрации апиксабана в крови по сравнению с пациентами с генотипами CC и CT. Следовательно, носительство аллеля Т может быть связано с повышенным клиренсом апиксабана [16]. Однако это исследование проводилось в азиатской популяции пациентов, что не позволяет экстраполировать результаты на другие этнические группы. В другом, более крупном исследовании, в котором проанализировали данные пациентов, участвовавших в третьей фазе клинического исследования апиксабана (ARISTOTLE) [11] авторы не повторили результаты исследования S. Ueshima и соавт. [16]. Эти расхождения, вероятно, можно объяснить с более надежными оценками воздействия апиксабана, большим размером выборки и достаточной мощностью исследованием. В другом небольшом российском исследовании А. В. Крюкова и соавт. не было найдено статистически значимых ассоциаций между фармакокинетикой апиксабана и полиморфизмом гена CYP3A5 rs776746 [24]. Результаты нашего исследования показали, что полиморфизмы генов CYP3A4*22 (rs35599367) C>T, CYP3A5*3 A>G не влияли на фармакокинетику апиксабана и риски развития геморрагических осложнений, что согласуется с результатами исследований, процитированных выше. Тем не менее дозирование апиксабана следует проводить с осторожностью и мониторировать нежелательные побочные реакций у пациентов, не экспрессирующих CYP3A5 (гомозиготных носителей нефункциональных аллелей).

При отсутствии возможности измерения активности Ха-фактора и равновесных концентраций ПОАК, доступной опцией для оценки безопасности и эффективности применения ПОАК в условиях стационара может быть измерение АЧТВ и ПВ [20]. Дабигатран может в большей степени удлинять АЧТВ, ривароксабан — ПВ [25]. В терапевтических дозах апиксабан вызывает небольшое удлинение АЧТВ и ПВ, но имеет высокую степень вариабельности [25]. Однако существует умеренная корреляция между концентрацией ПОАК и наблюдаемым изменением гемостаза. В нашем исследовании мы оценили влияние полиморфизмов генов CYP3A4*22 (c.522-191C>T, rs35599367), CYP3A5*3 (c.219-237A>G, rs776746), ABCB1 rs1045642 (c.3435T>C) и rs4148738 (c.2692-2236C>T) на показатели АЧТВ и ПВ и установили, что у носителей гомозиготного генотипа TT ABCB1 (rs1045642) C>T значение ПВ было статистически значимо выше, чем у генотипа CT p=0,044, что может быть важным для клинической практики с учетом невысокой стоимости данного анализа.

Следует отметить, что выявлено несоответствие распространенности генотипов полиморфного варианта ABCB1 (rs1045642) C>T равновесию Харди-Вайнберга, что ограничивает практическую значимость результатов. Но полученные результаты, тем не менее, следует считать важными при сравнении с последующими исследованиями.

Заключение

В нашем исследовании полиморфный вариант ABCB1 (rs4148738) C>T значимо ассоциировался со значением Сmin,ss/D. При этом мы не обнаружили статистически значимых ассоциаций между носительством полиморфизмов генов CYP3A4*22 (rs35599367) C>T, CYP3A5*3 A>G, ABCB1 (rs1045642) C>T и значением Сmin,ss/D апиксабана. Также мы не обнаружили статистически значимого влияния носительства полиморфизмов rs35599367, rs776746, rs4148738 и rs4148642 вышеуказанных генов на риски развития геморрагических осложнений. Однако, было установлено влияние полиморфизма ABCB1 (rs1045642) C>T на значение ПВ.

Для оптимизации клинической эффективности и максимальной безопасности современной антикоагулянтной терапии необходим системный индивидуальный подход на основе фармакокинетических исследований и фармакогенетического тестирования, которые позволят прогнозировать и профилактировать развитие геморрагических осложнений у пациентов, принимающих ПОАК, поэтому необходимы дальнейшие исследования в этой области.

Отношение и Деятельность. Нет.

Relationships and Activities. None.

Финансирование исследования: Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда 22-15-00251 №122060600001-4, "Персонализированное применение прямых пероральных антикоагулянтов на основе фармакогеномного подхода". Авторы не имеют других соответствующих связей или финансового участия с какой-либо организацией или предприятием, имеющим финансовый интерес или финансовый конфликт с предметом или материалами, обсуждаемыми в рукописи, кроме тех, которые были раскрыты.

Funding: This work was supported by Russian Science Foundation grant 22-15-00251 №122060600001-4, "Personalized Use of Direct Oral Anticoagulants Based on a Pharmacogenomic Approach". The authors have no other relevant affiliations or financial involvement with any organization or enterprise that has a financial interest or financial conflict with the subject matter or materials discussed in the manuscript, other than those disclosed.