Сравнительное исследование экспрессии циркулирующих микроРНК в крови у пациентов с атеросклерозом коронарных артерий и аневризмой грудной аорты

Введение

Регуляторные микроРНК являются универсальным эпигенетическим механизмом ген-генных взаимодействий. МикроРНК представляют собой короткие цепочки рибонуклеиновой кислоты (РНК, 12-20 нуклеотидов), синтезируемые эндогенно РНК-полимеразой 2 типа, которые влияют на трансляционную активность матричной РНК, таким образом изменяя синтез того или иного белка. В настоящий момент известно более 2300 микроРНК человека [1]. Актуально определение их экспрессии в качестве диагностических маркеров и потенциальных мишеней для терапии при многих патологиях, в том числе сердечно-сосудистых заболеваниях.

Цель исследования — сравнение относительных уровней экспрессии микроРНК, ассоциированных с сердечно-сосудистыми заболеваниями по данным литературы, в плазме крови пациентов с двумя вариантами хронического поражения сосудистой стенки: атеросклерозом коронарных артерий (КА) и аневризмой грудной аорты (АГА).

Материал и методы

В исследование включались пациенты, госпитализированные в клинический центр Первого МГМУ им. И. М. Сеченова (Университетская клиническая больница №1). Группу пациентов с АГА составляли больные, госпитализированные в клинику аортальной и сердечно-сосудистой хирургии для хирургического лечения. Всем пациентам в данной группе проводилась коронароангиография в рамках предоперационной подготовки. Диагноз АГА и показания для оперативного лечения соответствовали клиническим рекомендациям [2]. Группу КА составили амбулаторные пациенты с выявленным поражением коронарных артерий по данным мультиспиральной компьютерной томографии в рамках первичной диагностики ишемической болезни сердца. Контрольную группу составили амбулаторные пациенты с интактными коронарными артериями. Протокол обследования опубликован ранее [3].

Протокол исследования был одобрен этическим комитетом университета, протокол 119 от 14.07.2018 г.

Критерии включения:

1. Наличие письменного информированного согласия на участие в исследовании.
2. Возраст 18-80 лет;

Критерии невключения:

1. Беременность и период лактации;
2. Оперативные вмешательства в течение полугода до включения в исследование;
3. Скорость клубочковой фильтрации <45 мл/мин/
   1,73 м²;
4. Острый коронарный синдром, острое нарушение мозгового кровообращения в течение 6 месяцев до включения в исследование;
5. Хронические паренхиматозные заболевания печени и почек;
6. Известные аутоиммунные и аутовоспалительные заболевания, в том числе воспалительные аортиты;
7. Хроническая сердечная недостаточность II-IV функционального класса по классификации New York Heart Association;
8. Острые и хронические инфекционные заболевания;
9. Злокачественные новообразования;
10. Неврологические заболевания и психические расстройства.

У всех участников исследования фиксировали антропометрические и клинические данные, данные стандартной электрокардиографии покоя и трансторакальной эхокардиографии.

Проводили сбор анамнеза и физикальный осмотр пациентов. Регистрацию электрокардиограммы выполняли стандартным неавтоматизированным 12-канальным электрокардиографом Schiller. Трансторакальную эхокардиографию проводили штатные специалисты клиники на ультразвуковых аппаратах экспертного уровня по стандартным протоколам с измерением всех основных показателей.

Лабораторный контроль показателей общего и биохимического анализов крови выполнен межклинической лабораторией Сеченовского Университета.

После подписания информированного согласия у участников исследования были взяты образцы венозной крови в стандартную вакуумную пробирку с раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты объемом 6 мл. Детальное описание подготовки образцов плазмы крови и проводимой лабораторной диагностики описаны в предыдущей публикации [3].

Выбор исследуемых микроРНК основывался на результатах анализа научных данных об ассоциациях конкретных микроРНК или генов, связанных с микроРНК, с процессами сосудистого воспаления и атерогенеза ¹.

Критериями микроРНК для анализа служили следующие параметры:

1) микроРНК является специфичной для мРНК генов, вовлеченных в метаболические пути патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний;

2) уровень экспрессии микроРНК в плазме ассоциирован с сердечно-сосудистыми заболеваниями по данным литературы;

3) микроРНК детектируется в плазме с помощью выбранной ПЦР-методики со средними величинами Ct не более 35 циклов.

Итого, определялись уровни 12 циркулирующих микроРНК: miR-21-5p, -23a-3p, -29b-3p, -92a-3p, -126-5p, -143-3p, -145-5p, -146a-5p, -150-5p, -181b-5p, 2-23-3p и -451a.

Количественное определение микроРНК проводилось с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени. Данные представлены как после нормализации на уровень микроРНК 16-5p.

Анализ ассоциаций уровней микроРНК проводился в группах пациентов с АГА, КА и контрольной. Различия в уровнях микроРНК рассматривались как имеющие практическое значение при их кратности в 2 раза в более.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием программы Prism 9 (GraphPad, США). Нормальность распределения была определена с использованием теста Андерсона — Дарлинга. В случае нормального распределения, использовался метод ANOVA для сравнения между группами. В качестве непараметрических методов при отсутствии нормального распределения использовались U-критерий Манна-Уитни для попарного сравнения и критерий Краскела-Уоллиса для нескольких групп с ненормальным распределением. Для сравнения качественных переменных использовался критерий хи-квадрат. Значение p<0,05 считали значимым для всех тестов.

Результаты

Характеристика исследуемой выборки пациентов представлена в табл. 1.

Разделение пациентов на группы осуществлялось в соответствии с типом поражения сосудистой стенки. Аналогичный анализ был проведен и при делении пациентов по типу атеросклеротических бляшек (вне зависимости от классификации пациентов по различным шкалам).

Результаты сравнительного анализа относительных уровней циркулирующих микроРНК в объединенной группе КА и АГА против группы контроля представлены в табл. 2. Уровни miR-21-5p, -29b-3p и -126-3p показали более чем двукратную значимую разницу экспрессии.

Далее был проведен сравнительный анализ отдельных групп КА и АГА против контрольной. В группе КА значимые различия с контрольной группой продемонстрированы лишь для miR-143-3p (p=0,04), однако абсолютная разница средних уровней была менее чем двукратной. В то же время, у пациентов с АГА 11 из 15 микроРНК показали значимые различия экспрессии по сравнению с контролем (табл. 3), а 9 из них обладали более чем двукратным значимым приростом.

Поскольку у части пациентов АГА сопутствовала КА (n=22, 36,7%), повторно проведено сравнение с контрольной группой без их учёта. Двукратного изменения относительных уровней в плазме не отмечалось для miR-23a-3p, -92a-3p и -150-5p, однако оно выявлено для miR-205-5p и -223-3p. В связи с различиями профилей исследуемых микроРНК у пациентов с "чистой" АГА и сочетанной с КА был проведен сравнительный анализ, однако значимых различий не было выявлено.

Особый интерес представляет сравнительный анализ особенностей профилей циркулирующих микроРНК у пациентов с атеросклеротическим и аневризматическим сосудистым повреждением. Для определения специфических для КА циркулирующих микроРНК было проведено сравнение групп с КА против группы с АГА без КА. Значимое повышение экспрессии в группе КА отмечалось для 5 микроРНК (табл. 4), а для miR-126-3-p и -205-5p значимая кратность изменений была более чем в два раза.

В то же время сравнительный анализ "чистых" групп с КА и АГА показал картину, аналогичную сравнению АГА и контрольной группы, за исключением повышения уровня miR-23a-3p.

Обсуждение

В настоящем исследовании впервые проведён сравнительный анализ профилей циркулирующих микроРНК в плазме крови пациентов с двумя различными вариантами артериальной патологии: КА и АГА, а также с группой контроля.

При сравнении с контрольной группой наиболее выраженную разницу экспрессии у всех пациентов с артериальным повреждением продемонстрировали miR-21-5p, -29b-5p и -126-3p, что сопоставимо с результатами нашего предыдущего исследования [3].

Схожие результаты в отношении miR-21-5p описаны в исследовании Y. E. Torres-Paz и соавт., где у пациентов с повышенным уровнем данной микроРНК был выше риск развития КА [4]. МикроРНК miR-21 рассматривается в большей степени как тканевая, находящаяся в стенке сосуда и по-разному экспрессирующаяся при повышении напряжения сдвига или механическом воздействии на сосуд [4]. Нами был продемонстрирован значительно повышенный уровень указанной микроРНК именно в группе АГА, в то время как между группой КА и контролем значимой разницы не выявлено. Возможным объяснением является значительно большая площадь поражения артерий при АГА. В качестве одного из основных путей регуляторного действия miR-21-5p рассматривается воздействие на ген-супрессор опухолей PTEN, в результате которого изменяется экспрессия рецептора, активируемого пероксисомным пролифератором альфа (PPARa) и, в свою очередь, экспрессия провоспалительных факторов: молекулы адгезии эндотелия сосудов-1 (VCAM-1) и моноцитарного хемотаксического протеина-1 (MCP-1) [5]. Кроме того, PTEN — ингибитор сигнального пути PI3K/AKT, стимулирующего патологическую пролиферацию и апоптоз клеток [6], а также гена эндотелиальной синтазы оксида азота-3 [7]. При этом роль miR-21-5p рассматривается скорее как защитная, а сверхэкспрессия её у пациентов с АГА может служить диагностическим маркером, а также потенциальным терапевтическим агентом [8]. В отношении атеросклероза описана двойственная (атерогенная и атеропротективная) роль указанной микроРНК [9].

Изменения экспрессии miR-29b-5p у пациентов с аневризматическим или атеросклеротическим поражениями артерий отмечались ещё в ранних работах. Так, исследование D. R. Merk и соавт. продемонстрировало повышенные уровни miR-29b при раннем развитии аневризматических поражений у пациентов с синдромом Марфана [10], а также у пациентов с ранним началом атеросклероза [11]. Основными целями для данной микроРНК служат различные гены фибробластов, регулирующие процессы фиброза в экстрацеллюлярном матриксе. В отличие от miR-21-5p, сверхэкспрессия этой микроРНК рассматривается как патологический фактор как для атеросклероза, так и для АГА, и может служить целью для лекарственной терапии, что было показано в экспериментах in vivo [8][10][12][13].

Данные о повышенных уровнях miR-126-3p у пациентов с АГА и КА в нашем исследовании сопоставимы с результатами других авторов. Так, было показано, что уровни miR-126-3p/-5p повышаются у пациентов с синдромом Тёрнера и аневризмой аорты [14]. В исследовании S. Gasiulė и соавт. в группе пациентов с АГА экспрессия указанной микроРНК была выше в 1,88 раза (p<0,05) по сравнению с группой контроля, при этом в нашем исследовании разница была в 18 раз [15]. Вероятно, эти различия обусловлены как размером выборки, так и спецификой исследуемой популяции. У пациентов с атеросклеротическим поражением артерий также отмечаются повышенные уровни miR-126-3p [16][17].

Стоит отметить, что семейство miR-126-3p/-5p обладает определенной спецификой экспрессии. Так, в исследовании S. Gasiulė и соавт. демонстрируется разница в экспрессии miR-126-3p у пациентов с аневризмами грудного и брюшного отделов аорты, что указывает на ассоциацию преимущественно с АГА [15]. Кроме того, отмечаются различия в биологической роли при атеросклерозе для -3p и -5p вариантов данной микроРНК [18]. Вероятно, такие особенности экспрессии miR-126-3p обусловлены механизмами, через которые реализуется её регулирующая функция. В качестве основных целевых путей для данной микроРНК рассматриваются протеинкиназы, активируемые митогенами (путь MAPK/ERK) [17][19].

Помимо выявления глобальной разницы уровней циркулирующих микроРНК у пациентов с АГА, КА и группой контроля, важной задачей нашего исследования было определение молекул, которые помогут дифференцировать между собой патологические состояния. Полученные нами результаты говорят о том, что к таким молекулам относятся miR-205-5p, miR-195-5p, miR-143-3p.

Интересные данные получены для miR-205-5p. Уровни данной микроРНК у пациентов с КА были выше, чем у здоровых лиц. В то же время в группе пациентов с АГА уровни данной микроРНК значительно ниже, чем в группе контроля и, соответственно, чем в группе ИБС. Известно, что miR-205-5p отрицательно регулирует экспрессию белка 1, связанного с рецепторами липопротеинов низкой плотности (LRP1), что может привести к накоплению холестерина в стенках крупных артерий из-за нарушения регуляции пути LRP1/ABCA1, определяющего уровень холестерина [20]. Указанная микроРНК регулирует активность гена ERBB4, кодирующего белки семейства эпидермального фактора роста, а также усиливает негативное воздействие окисленных липопротеинов низкой плотности (oxLDL) [21]. Не исключено, что именно связь с oxLDL и miR-205-5p является одним из факторов дестабилизации атеросклеротической бляшки [22]. Если для атеросклероза повышение miR-205-5p в нашем исследовании сопоставимо с результатами других работ, описанных выше, то в отношении АГА мы получили противоречащие данные. Так, сверхэкспрессия miR-205-5p в исследованиях in vivo является одним из факторов, стимулирующих развитие аневризмы брюшного отдела аорты [8][23]. Биологическая роль miR-205-5p в развитии аневризматического повреждения заключается в стимуляции активности матричных металлопротеиназ, которые способствуют воспалению сосудов, ингибируя тканевой ингибитор металлопротеиназы 3 (TIMP3) и богатый цистеином белок, индуцирующий реверсию с мотивами kazal (RECK) [8]. Белок TIMP3 также несёт и атеропротективную функцию [24], что объясняет повышение уровней miR-205-5p в обеих группах. Также описано ингибирующее влияние miR-205-5p на белок "Матери против декапентаплегического гомолога 4" (SMAD4), являющегося одним из центральных звеньев сигнального пути фактора некроза опухолей β [25], что приводит к стимуляции апоптоза эндотелиоциов. Обращает на себя внимание тот факт, что основные исследования роли miR-205-5p в развитии аневризмы аорты относились именно к её брюшному отделу. Сравнительных данных по экспрессии циркулирующих miR-205-5p у пациентов с аневризмами аорты различной локализации на сегодняшний день нет.

Повышение уровней miR-143-3p и 195-5p в нашем исследовании — характерная черта для атеросклеротического поражения. Схожие данные были получены в нашей прошлой работе, где отдельно отмечалась роль miR-143-3p в качестве потенциального маркера уязвимости атеросклеротической бляшки [16].

Необходимы дальнейшие проспективные исследования, направленные на определение роли уровней miR-143-3p, -92a-3p, в качестве селективных маркеров атеросклеротического процесса, а также использования оценки уровней miR-205-5p и -195-5p в качестве маркеров дифференцировки КА и АГА. Проспективный характер исследования позволит использовать уровни указанных микроРНК не только как маркеров наличия и/или степени выраженности патологических изменений, но и выяснить их прогностическую значимость, тем самым усовершенствовав персонализированный подходк диагностике и лечению.

Стоит отметить, что другой сферой использования определения уровней циркулирующих микроРНК является мониторинг и оценка эффективности лекарственной терапии. Так, в исследовании Э. И. Рыткина и соавт. было показано, что miR-29, -34, -126, -142 и -223 отражают активность системы цитохрома Р-450, тем самым предоставляя возможность дифференцировать подход к терапии ингибиторами P2Y12-рецепторов [26].

Ограничения исследования

Основное ограничение — небольшой размер выборки и анализ лишь отобранных микроРНК, которые соответствовали теоретическим предпосылкам и доступной методологии на момент обследования. Исследование требует валидации на крупной выборке. В данном анализе не учитывался вклад терапии. Антитромботические, антигипертензивные препараты и статины могут влиять на экспрессию микроРНК в крови.

Заключение

Настоящее исследование продемонстрировало значительные различия уровней циркулирующих микроРНК у пациентов с атеросклеротическим и аневризматическим поражениями артерий в сравнении с группой контроля. Наиболее значимая разница выявлена для miR-21-5p, -29b-5p и -126-3p. Нами была показана потенциальная возможность использования трех циркулирующих микроРНК в дифференциальной диагностике КА и АГА. Результаты опубликованных исследований указывают на потенциальную возможность использования miR-205-5p в качестве маркера локализации аневризматического поражения аорты, однако данная гипотеза требует дальнейшего изучения.

Отношения и Деятельность. Нет.

Relationships and Activities. None.

Финансирование. Данная работа была профинансирована Министерством науки и высшего образования Российской Федерации в рамках государственной поддержки создания и развития исследовательских центров мирового уровня "Цифровой биодизайн и персонализированное здравоохранение" № 075-15-2022-304.

Funding. This work was financed by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation within the framework of state support for the creation and development of World-Class Research Centers "Digital biodesign and personalized healthcare" №075-15-2022-304.