Цитокиновый профиль оперированных пациентов с инфекционным эндокардитом

Введение

Инфекционный эндокардит (ИЭ) — заболевание преимущественно бактериальной природы, поражающее как нативные, так и протезированные клапаны/имплантированные внутрисердечные устройства [1][2]. В последнее десятилетие отмечены изменения профиля болезни, связанные с увеличением доли сложных форм, отличающихся трудностью визуализации клапанных изменений (ИЭ протеза клапана/внутрисердечных устройств/на фоне тяжелых дегенеративных пороков) и высокой долей ИЭ с неустановленной этиологией (в первую очередь из-за частого применения антибиотиков широкого спектра действия до постановки верного диагноза) [1-3]. Данные аспекты значительно ограничивают диагностику ИЭ, снижая чувствительность критериев Duke. В настоящее время основными диагностическими процедурами являются эхокардиография и микробиологические исследования, при этом среди критериев диагностики отсутствуют специфичные биомаркеры, способные идентифицировать ИЭ у пациентов с бактериемией. С-реактивный белок — чрезвычайно ценный, широко применяемый биомаркер, однако он обладает недостаточной чувствительностью и специфичностью, чтобы отличить пациентов с ИЭ от пациентов с бактериемией без ИЭ [4].

Ряд проведённых исследований позволяет предположить ценность воспалительных маркеров не только для мониторинга ответа на проводимую терапию, но и для ранней верификации ИЭ [5][6]. Необходимость поиска быстрых маркеров диагностики обусловлена сохраняющейся высокой летальностью при ИЭ и потребностью в своевременном начале индивидуализированной терапии [7][8].

Активированные клетки иммунной системы, в первую очередь макрофаги, выделяют цитокины, в разной степени участвующие в воспалительных процессах [9][10]. Баланс про- и противовоспалительных цитокинов во многом определяет тяжесть и исход заболевания [7][8]. В условиях постоянной бактериемии происходит непрерывная стимуляция иммунного ответа, что приводит к разному уровню концентрации цитокинов [5]. Показано, что интерлейкин 6 (ИЛ-6), интерлейкин 1β (ИЛ-1β) и фактор некроза опухоли-α (ФНО-α) играют важную роль в процессах воспаления. Известна связь провоспалительных макрофагов с неблагоприятным прогнозом у пациентов с сепсисом [11][12]. При ИЭ цитокиновый профиль исследован недостаточно, особенно при определении активности ИЭ у оперированных пациентов [13-15].

Цель исследования — изучить цитокиновый профиль макрофагов в тканях резецированных клапанов у оперированных пациентов с ИЭ, его связи с маркерами воспаления и исследовать возможность повышения эффективности оценки активности ИЭ.

Материал и методы

В проспективное исследование последовательно включены 25 взрослых пациентов с верифицированным активным ИЭ по критериям Duke 2015 г. и 24 взрослых пациента с порокам сердца без ИЭ, госпитализированных для кардиохирургического лечения с 2021 по 2022 г. Исключались пациенты с хроническими инфекционными заболевания в активной стадии процесса, сопутствующей острой патологией, аллергическими заболеваниями в стадии обострения, беременные, больные с неактивным ИЭ, небактериальным тромбоэндокардитом, активными онкологическими заболеваниями, получающие иммуносупрессивную терапию и не подписавшие письменного информированного согласия. Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice), принципами Хельсинкской декларации, одобрено локальным этическим комитетом Медицинского института Российского университета дружбы народов им. П. Лумумбы (протокол № 27 от 18.03.2021). Все пациенты подписали информированное согласие на сбор обезличенных медицинских данных.

Всем пациентам проводилось стандартное лабораторно-инструментальное обследование, предполагающее диагноз ИЭ, в том числе микробиологическое исследование крови/тканей резецированных клапанов, при необходимости дополненное молекулярно-биологическими исследованиями (полимеразная цепная реакция (ПЦР)-исследование крови/тканей резецированных клапанов), и эхокардиографическое исследование. Отдельно оценивался нейтрофильно-лимфоцитарный индекс (НЛИ), количество нейтрофилов/количество лимфоцитов. Дополнительно у каждого пациента основной группы и группы контроля в стерильных условиях операционной проводилось взятие тканей резецированных клапанов. Иссеченные ткани клапанов делили на 2 части: часть 1 фиксировали жидким азотом (-80° C) для приготовления криосрезов с исследованием фенотипических признаков макрофагов, часть 2 помещали в консервирующий буфер для проведения ПЦР Real Time с целью исследования экспрессии цитокинов макрофагами.

Исследование фенотипических признаков макрофагов

Для получения криосрезов замороженную ткань монтировали с помощью Tissue-Tek (Sakura, Нидерланды) на держателе для образцов криотома Leica СМ1900 (Leica, Германия), полученные срезы толщиной 6-7 мкм монтировали на предметные стекла с адгезивным покрытием Superfrost (Thermo Fisher Scientific, США). Далее выполняли гистологическое окрашивание гематоксилином, затем иммуногистохимическое окрашивание с раствором первичных антител anti-CD86 (PAA824Hu01) (1/200), anti-CD68 (DF7518) (1/200), anti-CD206 (ab64693) (1/200) и раствором антител Goat Anti-rabbit IgG PE (sc-3739) (1/200) с последующим докрашиванием ядра ядерным красителем — раствором 4’,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (0,004 мг/мл). Препараты фотографировали на флуоресцентном микроскопе Leica DM 4000В (Leica Microsystems, Германия) c помощью программы LAS AF v.3.1.0 (Leica Microsystems, Германия).

Исследование экспрессии цитокинов макрофагами

Методом ПЦР Real Time в тканях иссеченных клапанов сердца исследовали экспрессию генов провоспалительных (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-23, ФНО-α) и противовоспалительных (Аргиназа 1 (Арг-1), ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-13) цитокинов макрофагов. Из полученных образцов выделяли тотальную РНК с помощью набора RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN, Германия), далее осуществляли синтез копий ДНК (MMLV RT kit, Евроген, Россия), с которыми ставили реакцию с помощью готовых наборов реактивов (qPCRmix-HS SYBR, Евроген, Россия). Для анализа экспрессии генов использовали метод определения порогового цикла (Ct) и вычисления относительной экспрессии гена по методу M. V. Pfaffl [16] с учётом рекомендаций J. Vandesompele и соавт. [17]. В качестве эндогенного контроля выбран ген Gapdh. Дифференциальная экспрессия ключевых генов, регулирующих воспаление — провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и маркеров макрофагов (CD 68+) позволили определить роль этой клеточной популяции для заболевания. Исследование образца от каждого пациента проведено однократно.

Для изучения значимости про- и противоспалительных маркеров оценивались следующие конечные точки: комбинированный показатель (смерть от всех причин или рецидив ИЭ в течение 6 мес. после операции), госпитальная летальность, эмболические события, этиологическая принадлежность к Staphylococcus aureus.

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных проводили с применением пакетов прикладного программного обеспечения IBM SPSS Statistics, Version 27 и Excel 2016 (Microsoft, США). Для описания количественных переменных использовали среднее арифметическое значение (М) и стандартное отклонение среднего значения (SD) (для параметрических данных) или медиану (Me) и интерквартильный размах (IQR) (для непараметрических данных). С целью оценки нормальности распределения применялись критерий Шапиро–Уилка, Skewness тест. Статистическую значимость различий между двумя группами по количественным переменным оценивали при помощи U-критерия Манна–Уитни (для непараметрических данных) и t-теста Стьюдента (для параметрических данных). Качественные переменные описывали абсолютными (n) и относительными (%) частотами. Для определения статистической значимости различий качественных показателей использовали критерии хи-квадрат (χ2) и точный критерий Фишера. Корреляционный анализ проведен с расчётом коэффициентов корреляции Пирсона и Спирмена, последний рассчитывался при переменных, имеющих ненормальное распределение. Для оценки диагностической эффективности и влияния показателей использовали ROC-анализ (receiver operating characteristic) с определением площади под ROC-кривой (area under curve, AUC). Во всех видах анализа статистически значимым считалось значение p<0,05.

Результаты

Группы включённых в исследование пациентов не различались по основным клинико-демографическим и лабораторно-инструментальным параметрам, за исключением показателей воспаления, повышенных в группе пациентов с ИЭ (табл. 1).

Так как все пациенты с ИЭ были переведены из других стационаров для продолжения кардиохирургического лечения, то лихорадка и специфичные проявления заболевания встречались редко. В клинической картине преобладали аускультативные признаки и гепатоспленомегалия. В основной группе пациентов отмечалась высокая распространенность вторичных форм ИЭ, в первую очередь за счёт дегенеративных пороков сердца. Изолированный левосторонний ИЭ имелся у 16 (64,0%) пациентов, изолированный правосторонний ИЭ — у 7 (28,0%), двустороння локализация — только у 2 (8,0%) пациентов (табл. 2). В группе контроля представлены больные только с дегенеративными пороками сердца и левосторонней локализацией патологии (аортальный клапан — 20 (83,3%), митральный клапан — 2 (8,3%), аортальный клапан в сочетании с митральным клапаном — 2 (8,3%).

Медиана сроков диагностики ИЭ от появления первых симптомов составила 41 (IQR 25-64) день, а до операции — 62 (39-87) дня. Длительность госпитализации пациентов с ИЭ в кардиохирургическом стационаре составила (M±SD) 34±20,8 дня.

Этиологическая структура ИЭ среди 25 оперированных пациентов представлена Staphylococcus aureus — у 8 (32,0%), коагулазонегативными стафилококками — у 2 (8,0%), Enterococcus spp. — у 5 (20,0%), Bartonella sp. — у 3 (12,0%), Streptococcus viridans — 1 (4,0%), Streptococcus gallolyticus (bovis) — у 1 (4,0%), не выявлен патоген у 5 (20,0%).

По результатам иммуногистохимического исследования, позволившего определить наличие неповрежденных макрофагов в эндокарде оперированных пациентов с ИЭ и без ИЭ, выявлены CD 68+ (общий маркер макрофагов), СD 86+ (маркер провоспалительного фенотипа макрофагов) и CD 206+ клеток (маркер противовоспалительного фенотипа макрофагов) (рис. 1). При этом по результатам количественного анализа отмечено преобладание провоспалительного фенотипа макрофагов CD 86+ в группе оперированных пациентов без ИЭ по сравнению с пациентами с ИЭ (0,054 (0,029-0,073) vs 0,008 (0,0071-0,0096), p=0,0034), в то время как в отношении противовоспалительного фенотипа макрофагов CD 206+ статистически значимых различий не получено (0,028 (0,010-0,030) vs 0,013 (0,0095-0,016), p=0,67).

Исследование уровней экспрессии генов цитокинов макрофагами в тканях клапанов показало, что провоспалительные цитокины ИЛ-1β, ФНО-α и ИЛ-6 были повышены в группе оперированных пациентов с ИЭ, при этом значимые различия получены только в отношении ИЛ-1β и ИЛ-6 (табл. 3). В отношении остальных провоспалительных и противовоспалительных цитокинов значимых различий между оперированными пациентами с и без ИЭ не получено.

Исследование уровня экспрессии генов цитокинов макрофагами в зависимости от наличия эмболических событий, этиологической принадлежности к S. aureus, а также госпитальной летальности и комбинированной конечной точки (смерть от всех причин или рецидив ИЭ через 6 мес. после операции) не показало различий между оперированными пациентами с ИЭ с событиями или без (табл. 4-7).

Таким образом, имелась тенденция к повышенной экспрессии генов провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-1β, ФНОα) макрофагами в тканях резецированных клапанов у пациентов с неблагоприятным и/или осложнённым течением ИЭ, однако статистической значимости различия не достигали, вероятно, по причине небольшой выборки пациентов.

Далее у оперированных пациентов с ИЭ изучена связь провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6) с лабораторными маркерами воспаления. Выявлены сильные и умеренные положительные связи между ИЛ-1β и ИЛ-6, а также между интерлейкинами с уровнем лейкоцитов и НЛИ (табл. 8).

По данным ROC-анализа показано, что ИЛ-1β, лейкоцитоз и НЛИ обладают благоприятными характеристиками для применения в качестве диагностических тестов на активность ИЭ у оперированных пациентов (ИЛ-1β AUC 0,816 (p=0,02), НЛИ AUC 0,807 (p=0,03), лейкоцитоз AUC 0,714 (p=0,03)). При этом ИЛ-6 не продемонстрировал диагностической значимости у пациентов с ИЭ (рис. 2).

Таким образом, по результатам иммуногистохимического исследования, направленного на выявление неповрежденных макрофагов в эндокарде оперированных пациентов с и без ИЭ, выявлено преобладание провоспалительного фенотипа макрофагов среди оперированных пациентов без ИЭ. Одновременно с этим отмечена повышенная экспрессия генов провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β и ИЛ-6) макрофагами в тканях клапанов оперированных пациентов с ИЭ. При этом не получено значимых различий по уровню экспрессии генов про- или противовоспалительных цитокинов в зависимости от наличия осложнений ИЭ. ИЛ-1β продемонстрировал высокую диагностическую ценность для определения активности воспаления у оперированных пациентов с ИЭ.

Обсуждение

Диагностика ИЭ часто затруднена и основана на совокупности клинических данных, этиологического обследования и параметров эхокардиографии. Стёртый (в ряде случаев) характер течения болезни приводит к задержке постановки диагноза и своевременного начала терапии, что неблагоприятно влияет на показатели летальности. В связи с чем изучение значения биомаркеров для диагностики ИЭ может иметь важное значение.

В представленном исследовании изучены особенности цитокинового профиля у оперированных пациентов с и без ИЭ. Выполнено иммуногистохимическое исследование тканей на предмет выявления неповрежденных макрофагов. Определены сывороточные уровни экспрессии генов про- и противовоспалительных цитокинов тканевыми макрофагами. Проведена оценка уровня воспалительных маркеров с точки зрения определения активности ИЭ у оперированных пациентов.

Морфофункциональные особенности макрофагов у пациентов с инфекциями кровотока исследованы недостаточно. Основные научные данные получены у пациентов с сепсисом, в то время как при ИЭ исследования остаются единичными. Макрофаги относятся к ключевым участникам врожденного иммунитета, представлены в разных тканях и выполняют множественные функции, включая секрецию про- и противовоспалительных цитокинов [10][18-20]. Известно, что провоспалительные цитокины ассоциированы с неблагоприятным прогнозом при тяжёлых инфекционных состояниях. Некоторыми авторами обсуждается потенциальная роль цитокинов в определении активности ИЭ, в том числе у оперированных пациентов [21-23]. Более того, существует предположение, что избыточная воспалительная реакция, вызванная рядом провоспалительных цитокинов, например, ИЛ-8, ИЛ-6, интерфероном-γ, может привести к повреждению тканей клапанов, свидетельствовать о плохом контроле течения ИЭ и неблагоприятном прогнозе [7][8][11][18].

В настоящей работе изучена экспрессия генов цитокинов тканевыми макрофагами и выявлена тенденция к преобладанию провоспалительного фенотипа у оперированных пациентов с ИЭ. Статистически значимые различия с оперированными пациентами с клапанными пороками без ИЭ получены только в отношении ИЛ-1β и ИЛ-6, что согласуется с экспериментальными данными на животных и единичными клиническими исследованиями [21-24]. При этом не получено различий по уровню экспрессии генов провоспалительных цитокинов в зависимости от осложненного течения ИЭ, что ранее отмечено в работах R. W. Watkin и соавт. [21] и P. Alter и соавт. [22].

Известно, что стафилококковый ИЭ (в первую очередь вызванный S. aureus) отличается тяжелым деструктивным поражением клапанного аппарата, в связи с чем обсуждается его патогенетическая связь с избытком образования провоспалительных цитокинов, например, ИЛ-6, ИЛ-1β и ФНО-α [14]. В настоящем исследовании не получено убедительных различий между стафилококковым и нестафилококковым ИЭ, однако отмечены повышенные более чем в 2 раза уровни провоспалительных цитокинов при ИЭ, вызванном S. aureus. Данный аспект, вероятно, объясняется недостаточной статистической мощностью исследования и определяет необходимость дальнейшего анализа.

Взаимосвязи между клетками воспаления и их влияние на степень развития воспалительной реакции остаются недостаточно изученными механизмами. В настоящем исследовании у пациентов с ИЭ выявлена корреляция провоспалительных цитокинов ИЛ-1β и ИЛ-6 между собой и с маркерами воспаления, такими как лейкоциты и НЛИ. При этом ИЛ-1β продемонстрировал наиболее благоприятные характеристики в качестве диагностического маркера активного воспаления в тканях резецированных клапанов у пациентов с ИЭ, превосходящие повышенный уровень лейкоцитов. Аналогичные данные ранее продемонстрированы только в отношении ИЛ-6 и С-реактивного белка [21]. Таким образом, ИЛ-1β может быть независимым от клеточного иммунитета диагностическим критерием активности ИЭ, обладающим потенциалом биомаркера для оценки тяжести клапанного повреждения.

При сепсисе выявлена уникальная патогенетическая связь, когда одновременно с начальной провоспалительной реакцией развивается интенсивный противовоспалительный ответ. ИЛ-10 как один самых сильных противовоспалительных цитокинов может быть обнаружен в высокой концентрации в острую фазу сепсиса [8][18]. В настоящей работе не получено значимых различий по уровню ИЛ-10 у оперированных пациентов с ИЭ ни в отношении пациентов без ИЭ, ни в отношении осложнений ИЭ или связи с S. aureus. Данный аспект согласуется с ранее проведенными исследованиями [8], а также может указывать на характерные отличия ИЭ от сепсиса, связанные с более затяжным течением и менее выраженной острой воспалительной реакцией при ИЭ, приводящей к устойчивой провоспалительной реакции и деструктивными процессам в клапанах сердца.

Также не удалось выявить значимых различий в отношении экспрессии генов ФНО-α у оперированных пациентов с и без ИЭ, а также в зависимости от осложнённого течения ИЭ, что подтверждается серией ранее выполненных исследований [21][23]. Этот феномен может быть связан с истощением активности иммунных клеток на фоне постоянной стимуляции в условиях характерного для ИЭ длительного воспаления, что приводит к снижению экспрессии некоторых цитокинов, в частности ФНО-α, однако для подтверждения данного предположения необходимы дальнейшие исследования.

Наиболее интересными оказались результаты, показавшие, что у оперированных пациентов с ИЭ при наблюдаемой значимо более высокой экспрессии генов провоспалительных цитокинов и белка CD 86+ (маркер провоспалительного фенотипа макрофагов) методом ПЦР Real time, одновременно выявлялся феномен "макрофагального провала", представленный низким количеством целых клеток провоспалительного фенотипа макрофагов CD 86+ при иммуногистохимическом исследовании. Данное явление предположительно связано со способностью нейтрофильных внеклеточных ловушек к стимулированию пироптоза макрофагов, в результате которого происходит разрушение макрофагов с неконтролируемым высвобождением внутриклеточных провоспалительных молекул во внеклеточное пространство, приводящее к чрезмерному воспалению по аналогии с сепсисом [25]. Именно данные патологические процессы у пациентов с ИЭ, вероятно, определяют развитие структурных нарушений клапанного аппарата сердца, неконтролируемого течения инфекции, формирование эмбологенных вегетаций и потребность в кардиохирургическом лечении. Однако это предположение требует дальнейшего изучения и подтверждения.

Ограничения исследования

Ограничения исследования — набор пациентов в одном центре и небольшая выборка пациентов. Также большинству обследованных проводилась активная антибактериальная терапия до кардиохирургического лечения, что могло повлиять на оценку результатов, определив относительно высокий уровень противовоспалительных цитокинов в группе ИЭ. Низкая частота развития анализируемых неблагоприятных событий в небольшой выборке пациентов, вероятно, послужила причиной отсутствия статистически значимых различий в степени экспрессии провоспалительных цитокинов у пациентов с ИЭ с событиями. Авторы имели возможность определить тенденции к преобладанию того или иного фенотипа макрофагов, а также предполагать наличие связи макрофагов с нейтрофильными внеклеточными ловушками через пироптоз, в связи с чем проведённое исследование является пилотным и необходимо дальнейшее изучение макрофагов у пациентов с ИЭ.

Заключение

В проведённом исследовании показано, что тканевые макрофаги экспрессируют высокие уровни провоспалительных цитокинов ИЛ-1β и ИЛ-6 у оперированных пациентов с ИЭ вне зависимости от этиологической принадлежности или осложнённого течения заболевания. При этом ИЛ-1β обладает высокой диагностической ценностью для определения активности клапанного воспаления при ИЭ. Деструктивные процессы в клапанах оперированных пациентов с ИЭ, по-видимому, обусловлены феноменом "макрофагального провала", приводящего к разрушению макрофагов с неконтролируемым высвобождением провоспалительных цитокинов во внеклеточное пространство с последующим чрезмерным воспалением. Таким образом, исследование цитокинового профиля является диагностическим инструментом определения активности ИЭ и выделения пациентов неблагоприятного риска.

Отношения и Деятельность. Нет.

Relationships and Activities. None.

Финансирование: Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 22-75-10012) с использованием биоматериала человека, собранного и сохраняемого в рамках научной программы. Оборудование для сбора, хранения и транспортировки биоматериала человека, оборудование для обследования пациентов приобретено за счёт средств Программы стратегического академического лидерства РУДН.

Funding: The work was supported by a grant from the Russian Science Foundation (project No. 22-75-10012) using human biomaterial collected and preserved as part of a scientific program. Equipment for the collection, storage and transportation of human biomaterials, and equipment for examining patients were purchased with funds from the RUDN University Strategic Academic Leadership Program.