Оценка уровней Wnt1 и Wnt3a у больных стабильной ишемической болезнью сердца с различными вариантами поражения коронарных артерий

Введение

Современные исследования патогенеза ишемической болезни сердца (ИБС) посвящены изучению молекулярных механизмов развития различных фенотипов заболевания (обструктивное и необструктивное поражение коронарных артерий (КА)). Сигнальный каскад Wnt/β-катенин — это высококонсервативная система, обеспечивающая взаимодействие между клетками и регулирующая их пролиферацию, дифференцировку и выживание, что делает его значимым фактором в патогенезе ИБС [1][2].

Группа Wnt включает 19 гликопротеинов, способных запускать либо канонический сигнальный путь (с вовлечением β-катенина), либо неканонические ветви передачи сигнала, включая кальций-зависимый путь и путь пространственной клеточной полярности (planar cell polarity (Rho/PCP)) [3]. В каноническом варианте активация рецепторов Frizzled и ко-рецептора липопротеидов низкой плотности (ЛНП) LRP5/6 (low density lipoprotein receptor 5/6) приводит к инактивированию деструктивного комплекса β-катенина. Это, в свою очередь, инициирует накопление β-катенина в цитоплазме, его транслокацию в ядро и активацию транскрипции генов, кодирующих медиаторы клеточного роста, воспаления и выживания [4][5].

Семейство Wnt-белков, первоначально описанное в контексте эмбриогенеза, играет ключевую роль в регуляции функций гладкомышечных клеток (ГМК). Современные исследования свидетельствуют о том, что Wnt-сигнальный путь осуществляет модуляцию процессов пролиферации, миграции и выживаемости ГМК посредством активации как β-катенин-зависимых, так и β-катенин-независимых сигнальных путей, что в свою очередь, может приводить к развитию эндотелиальной дисфункции, окислительному стрессу и гемодинамически значимому стенозированию КА [6][7]. Белки Wnt3a и Wnt5a обнаруживаются в атеросклеротических бляшках, где они способствуют миграции ГМК сосудов, их пролиферации и апоптозу, а также поддерживают локальное воспаление [6][8][9]. Более того, имеющиеся данные свидетельствуют о положительной корреляции между уровнями Wnt3a и маркерами системного воспаления, C-реактивным белком (СРБ), интерлейкином-6 (ИЛ-6), интерлейкином-1β (ИЛ-1β) и нарушениями липидного обмена у пациентов с прогрессированием атеросклероза КА при ИБС [10].

Следует подчеркнуть, что Wnt3a не только индуцирует воспалительный ответ, но и обладает эффектом, повышающим клеточную выживаемость, усиливая экспрессию белков, поддерживающих жизнеспособность сосудистых ГМК, таких как WISP-2 (Wnt1-inducible-signaling pathway protein 2, белок 2 индуцируемого сигнального пути Wnt1) [11]. Кроме того, исследования показали, что Wnt-каскад участвует в развитии патологической гипертрофии и дилатационного ремоделирования миокарда [12].

Таким образом, путь Wnt/β-катенин является одним из центральных молекулярных процессов воспаления, ремоделирования и дегенерации, лежащих в основе развития и прогрессирования ИБС. Представляется целесообразным исследовать уровни компонентов сигнального каскада, в частности Wnt1 и Wnt3a, в группах пациентов с различными вариантами поражения КА.

Цель исследования — оценить уровни белков Wnt1 и Wnt3a в плазме крови у пациентов со стабильной ИБС в зависимости от варианта поражения КА — обструктивного (оИБС) и необструктивного (ноИБС), а также у здоровых лиц группы контроля.

Материал и методы

В одномоментное (поперечное) исследование, проведённое на базе Университетской клинической больницы №1 Клинического центра Сеченовского Университета, было включено 72 пациента с верифицированным диагнозом стабильной ИБС в возрасте 45-75 лет (диагноз установлен согласно клиническим рекомендациям по стабильной ИБС 2024 г.¹) и 30 здоровых лиц (группа контроля) без факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний.

Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и было одобрено локальным этическим комитетом (протокол № 01-21 от 22 января 2021 г.). Все участники подписали добровольное информированное согласие.

Критериями невключения являлось наличие у пациентов сахарного диабета, острого коронарного синдрома, инфаркта миокарда в последние 3 мес., острого нарушения мозгового кровообращения, хронической сердечной недостаточности (III-IV функционального класса по NYHA (The New York Heart Association)), аутоиммунных или онкологических заболеваний, тяжелых нарушений функции печени и почек.

У госпитализированных больных с клиническими проявлениями стабильной стенокардии, наличие ишемии миокарда было верифицировано посредством применения инструментальных методов диагностики, включая стресс-эхокардиографию или однофотонную эмиссионную компьютерную томографию миокарда (сцинтиграфия миокарда) с проведением нагрузочной пробы.

Всем пациентам проведено стандартное лабораторное обследование, включающее клинические анализы крови и мочи, биохимический анализ с определением показателей липидного спектра, глюкозы, мочевой кислоты, и инструментальная диагностика: электрокардиография (ЭКГ), мониторирование ЭКГ по Холтеру, ЭхоКГ. Всем участникам определялись уровни белков Wnt1 и Wnt3a, эндотелина-1, СРБ, ИЛ-6 и интерлейкина-1β (ИЛ-1β) методом иммуноферментного анализа.

Согласно результатам коронарной ангиографии и мультиспиральной компьютерной томографии КА, пациенты были разделены на две группы. В группу ноИБС включили пациентов с необструктивным поражением КА, соответствующим критериям INOCA (Ischemia with No Obstructive Coronary Artery Disease)/ANOCA (Angina with No Obstructive Coronary Artery Disease), со стенозами менее 50% или с интактными КА. В группу оИБС включены 42 пациента с гемодинамически значимыми стенозами КА. Группу контроля составили 30 здоровых добровольцев.

Образцы плазмы крови после центрифугирования были заморожены в криопробирках при температуре -80 °C. Центрифугирование образцов проводилось в течение 20 мин с этилендиаминтетрауксусной кислотой К3 в качестве антикоагулянта. Для оценки концентрации белков каскада Wnt использовали иммуноферментный анализ на иммуноферментном анализаторе Adaltis Personal Lab (Италия) с помощью наборов Cloud-Clone Corp., США. Коэффициент вариации (CV) у наборов составил 10%.

Статистический анализ был проведен с использованием программ StatTech v. v. 4.8.5 (Статтех, Россия) и SPSS версия 26.0 (IBM, USA). Распределение количественных переменных оценивали с помощью критерия Шапиро–Уилка (n<50). Категориальные переменные описывались с указанием абсолютных значений (n) и долей (%). Количественные переменные, соответствующие нормальному распределению, описывались с использованием среднего арифметического (M) и стандартного отклонения (SD). В случае отклонения от нормального распределения применялось непараметрическое описание: медиана (Me), нижний и верхний квартиль (Q1; Q3). Для сравнения количественных показателей между двумя независимыми группами использовали t-критерий Стьюдента, U-критерий Манна–Уитни. При сравнении более двух групп применялась параметрическая статистика — однофакторный дисперсионный анализ ANOVA с определением F-критерия Уэлча, непараметрическая статистика — критерий Краскела–Уоллиса, далее проведен post-hoc анализ с апостериорным множественным сравнением (анализ межгрупповых различий). Для оценки различий долей в таблицах сопряженности применялся точный критерий Фишера. С помощью факторного анализа построена корреляционная матрица с извлечением компонентов, мера адекватности оценена с помощью критерия Кайзера–Мейера–Олкина, для оценки значимости выбран критерий сферичности Бартлетта. Отбор каждого из исследуемых показателей и корреляционная связь с компонентами проведены с помощью вращения методом «Varimax rotation». Бинарная логистическая регрессия была построена с помощью метода Вальда с пошаговым отбором, с определением значимости модели с помощью критерия хи-квадрат, коэффициент детерминации R-квадрат Нэйджелкерка, вычислены скорректированные отношения шансов (ОШ) для предикторов, включенных в прогностическое регрессионное уравнение. Во всех случаях статистические различия считались значимыми при значении p <0,05, а при p <0,001 — высоко значимыми.

Результаты

Клинико-демографические характеристики исследуемых групп пациентов, такие как возраст и индекс массы тела, не имели статистически значимых различий (р >0,05) (табл. 1). Отмечались существенные различия по половому составу: в группе ноИБС доля лиц женского пола составила 62,5%, в то время как в группе оИБС преобладали мужчины (71,4%).

В исследуемой когорте были обнаружены значимые различия в липидном профиле между группами. У пациентов с ноИБС уровень липопротеинов низкой плотности был значительно выше, чем в группе оИБС (2,89 [ 2,30-3,68] ммоль/л vs 2,19 [ 1,56-2,75] ммоль/л; p=0,006). Аналогично, концентрация общего холестерина также была существенно повышена в группе ноИБС по сравнению с группой оИБС (5,17±1,50 ммоль/л против 3,85±1,13 ммоль/л, соответственно; p <0,001 (табл. 1). Выявленные различия могут быть связаны с более интенсивной медикаментозной терапией, направленной на коррекцию липидного профиля у пациентов с диагнозом оИБС.

Анализ концентраций маркеров системного воспаления (СРБ, ИЛ-1β и ИЛ-6) не выявил статистически значимых различий между исследуемыми группами (p >0,05). Однако, при сопоставлении значений эндотелина-1 установлены статистически значимые различия: в группе ноИБС уровень эндотелина-1 составил 33,5 [ 25,2-50,0] пг/мл, тогда как в группе оИБС зафиксированы значимо более низкие показатели (27,3 [ 20,5-32,0] пг/мл; p=0,027) (табл. 2).

При анализе концентрации Wnt1 у пациентов с оИБС и ноИБС выявлены статистически значимые различия: медианное значение Wnt1 в группе ноИБС — 0,15 [ 0,15 -0,15] нг/мл, тогда как в группе оИБС — 0,19 [ 0,19-0,21] нг/мл (р <0,001). В контрольной группе концентрация Wnt1 была статистически значимо выше, чем в группе с ноИБС (p <0,001), но меньше, чем в группе с оИБС (p=0,001) (табл. 3).

При анализе концентрации Wnt3a наименьшее значение было выявлено у пациентов с ноИБС (0,11 [ 0,06-0,15] нг/мл) в отличие от группы оИБС (0,24 [ 0,18-0,29] нг/мл; p <0,001) и контрольной группы (0,25 [ 0,16-0,37] нг/мл; p <0,001) (табл. 4).

Для определения корреляционных отношений количественных показателей был проведен факторный анализ среди пациентов с различными вариантами поражения КА при ИБС. В многофакторный анализ были включены лабораторные показатели, продемонстрировавшие статистически значимые различия между группами при однофакторном сравнении, а именно: общий холестерин, холестерин ЛНП, Wnt1, Wnt3a, эндотелин-1 и мочевая кислота. В результате многофакторного анализа получена корреляционная матрица, определившая по максимальной факторной нагрузке, две основных компоненты (табл. 5).

Показатели холестерина ЛНП и общего холестерина имели наиболее выраженные прямые корреляционные связи и были объединены в 1 компоненту (липидный профиль). Уровни Wnt1 и Wnt3a с прямой корреляционной связью и эндотелин-1 с отрицательной были объединены во 2 компоненту (повреждение эндотелия). Мочевая кислота имела слабые корреляционные связи с обеими компонентами (<0,5). Мера выборочной адекватности Кайзера–Мейера–Олкина составила 0,60, что указывает на удовлетворительную адекватность факторного анализа. Уровень значимости, оцененный с помощью критерия сферичности Бартлетта, составил р <0,001, что свидетельствует о приемлемости факторного анализа в данной выборке.

Для обеих компонент проведен ROC-анализ для оценки прогностической эффективности для распределения пациентов в определенную группу ИБС (табл. 6).

Wnt1, Wnt3a и эндотелин-1 были выбраны в качестве переменных для проведения многофакторного анализа на основании существования патофизиологических данных об их участии в таких процессах, как ремоделирование и воспаление, которые являются неотъемлемой частью патогенеза различных вариантов атеросклеротического поражения КА.

В результате анализа в регрессионное уравнение были включены только уровни Wnt1 и Wnt3a и были получены скорректированные ОШ: увеличение Wnt1 на 1 нг/мл увеличивает вероятность распределения в группу с оИБС в 1,05 раз, а увеличение Wnt3a на 1 нг/мл повышает вероятность в 1,016 раз (табл. 7). Модель была статистически значима (р<0,001) и, согласно коэффициенту детерминации Найджелкерка, определяет 68,2% дисперсии вероятности принадлежности пациентов к группе оИБС.

Чувствительность модели составила 97,5%, специфичность 91,3%, общая прогностическая эффективность 95,2%. Точность данной регрессионной модели была проверена в ROC-анализе (рис.), была получена площадь под кривой 0,953±0,029 (95% ДИ 0,897-0,999, р=0,029), пороговое значение Р=0,559.

Таким образом, концентрации Wnt1 и Wnt3a потенциально могут обладать высокой прогностической эффективностью в отношении определения принадлежности пациентов к группе с обструктивным вариантом поражения КА при ИБС.

Обсуждение

В проведенном исследовании уровни сигнальных белков Wnt1 и Wnt3a были выше у пациентов в группе оИБС. Однако ключевые результаты связаны с данными многофакторного анализа. Именно он позволил объединить Wnt1, Wnt3a и эндотелин-1 в компоненту, которая продемонстрировала диагностическую способность в дифференциации вариантов поражения КА. Несмотря на полученные значения AUC и результаты логистической модели, роль этих маркеров и их комбинированной интерпретации остаётся предметом дальнейшего обсуждения, особенно учитывая неоднородность выборки и возможные биологические различия между группами.

Что касается статистически значимых различий по полу среди больных с различными вариантами поражения КА, выявленных в проведенном исследовании, то по клиническим и эпидемиологическим данным, ишемия миокарда при отсутствии стенозов КА (INOCA/ANOCA) чаще диагностируется у женщин, на долю которых приходится до 65% необструктивного варианта поражения КА при ИБС. У женщин нередко доминируют микрососудистые и вазомоторные нарушения. Напротив, обструктивная форма коронарного атеросклероза чаще выявляется у мужчин, что связано с более частым формированием у них крупных атеросклеротических бляшек [13].

В исследовании Y. Liu. и соавт., у больных с обструктивным поражением КА уровни Wnt1 и Wnt3a в плазме крови были выше, чем у здоровых лиц [14]. Более того, активность сигнального каскада Wnt различается в зависимости от варианта поражения КА при ИБС. Было показано, что белок Wnt3a преимущественно локализуется в зонах атеросклеротического поражения и практически не выявляется в неизмененных артериях, что указывает на его вовлеченность в процессы формирования бляшек и, как следствие, на более высокие уровни этого маркера у пациентов с оИБС по сравнению с лицами, у которых ишемия развивается без значимого сужения коронарного русла (INOCA/ANOCA) [6].

В представленном исследовании показано, что уровни белков Wnt1 и Wnt3a были статистически значимо выше у пациентов с оИБС по сравнению с пациентами с ноИБС и контрольной группой. Возможная диагностическая ценность этих маркеров для разграничения указанных форм заболевания была подтверждена результатами ROC-анализа. Таким образом, можно предположить, что для пациентов с оИБС характерна более выраженная активация каскада Wnt (Wnt1 и -3а). Примечательно, что в выполненной работе выявлено значимое повышение эндотелина-1 у пациентов с ноИБС. Аналогичные результаты были зафиксированы и в работе M. Naya и соавт.: уровень эндотелина-1 был значительно повышен у людей с ишемией миокарда без ангиографически значимых стенозов КА (INOCA), что указывает на выраженную эндотелиальную дисфункцию и вовлеченность микроциркуляторного русла в патогенез данного варианта поражения КА при стабильной ИБС [15].

Wnt-каскад может оказывать влияние на практически все этапы атерогенеза: эндотелиальную дисфункцию, инфильтрацию моноцитов, пролиферацию и миграцию ГМК сосудов и формирование атеросклеротической бляшки. Так, при связывании Wnt-лигандов с эндотелиальными клетками индуцируются циклооксигеназа-2 и провоспалительные цитокины через Ca²⁺/PKC-путь, что способствует эндотелиальной дисфункции и сосудистому воспалению [16,17]. В то же время дисбаланс Wnt-каскада способствует накоплению в сосудистой стенке липидов и развитию атеросклероза [18][19].

Результаты проведенного исследования согласуются с имеющимися данными, подтверждающими гипотезу о том, что сигнальный путь Wnt-β-катенин вовлечен в регуляцию воспалительных, пролиферативных и метаболических аспектов атерогенеза.

Полученные данные демонстрируют повышенный уровень белка Wnt3a в группе контроля по сравнению с пациентами с необструктивной ИБС. Этот результат представляет особый интерес, поскольку противоречит данным некоторых исследований, проведенных в контексте других заболеваний, таких как аллергический ринит и хроническая венозная недостаточность [20][21]. Wnt3a является важным звеном канонического пути Wnt и участвует в регуляции миграции и адгезии сосудистых ГМК [22]. Согласно данным B.A. Brown и соавт., уровень Wnt3a значительно повышен в атеросклеротических бляшках по сравнению с интактными артериями. Wnt3a также участвует в подавлении апоптоза сосудистых ГМК, вызванного H₂O₂, посредством сигнального пути β-катенин/TCF и последующей активации WISP-2 [23]. Вместе с тем, Wnt3a опосредованно подавляет транскрипцию генов, зависящую от NF-êβ, и, таким образом, защищает от воспаления. Так, терапия с использованием Wnt3а способствовала значительному снижению экспрессии IL1β, IL6 и колониестимулирующего фактора-2 [24]. Эти данные могут частично объяснять наибольшую концентрацию данного белка, полученную нами в группе контроля. Необходимо отметить, что роль сигнального каскада Wnt в развитии необструктивного поражения КА практически не изучена. Полученные в представленном исследовании результаты могут быть обусловлены необходимостью проведения исследования на большей выборке пациентов и здоровых лиц.

Ограничения исследования

В представленной работе относительно небольшой объем выборки, в частности, в группе пациентов ноИБС (n=30), что может снижать статистическую мощность анализа. Работа была выполнена в рамках одноцентрового исследования, что ограничивает возможность экстраполяции выводов на более широкие популяции пациентов. Одномоментный характер исследования не позволяет оценить динамику уровней Wnt1/Wnt3a в долгосрочной перспективе и их ассоциацию с прогрессированием ИБС, что требует проведения длительных проспективных исследований.

Заключение

Проведенное исследование, реализованное в клинических условиях с участием когорт пациентов с различными вариантами поражения КА при ИБС, продемонстрировало, что уровни сигнальных белков канонического каскада Wnt (Wnt1 и Wnt3a) выше при оИБС по сравнению с ноИБС. Полученные данные демонстрируют вероятные диагностические возможности исследуемых биомаркеров в определении различных вариантов поражения КА у больных стабильной ИБС, что позволяет рассматривать их в качестве потенциальных инструментов молекулярной стратификации в клинической практике.

Таким образом, полученные данные могут иметь потенциальное значение для уточнения значимости компонентов Wnt/β-катенин-каскада в процессе формирования и прогрессирования атеросклеротического поражения КА, что в перспективе открывает возможности для клинического применения Wnt1 и Wnt3a в качестве чувствительных и специфичных молекулярных биомаркеров для диагностики, мониторинга и, потенциально, в персонализированной терапии хронической ИБС.

Необходимо проведение крупномасштабных исследований для оценки роли Wnt-каскада в развитии и прогрессировании ИБС, что позволит создать диагностическую панель с использованием сигнальных молекул, а также рассмотреть его как потенциальную мишень для проведения патогенетической терапии.

Отношения и Деятельность. Исследование проведено при поддержке Российского научного фонда, грант № 22-15-00424-П «Роль активации сигнального каскада WNT, процессов его эпигенетической регуляции и иммуноопосредованного воспаления в прогрессировании атеросклероза и возможности влияния на него методом терапевтического неоангиогенеза у пациентов со стабильной ишемической болезнью сердца».

Relationships and Activities. The study was conducted with the support of the Russian Science Foundation, grant No. 22-15-00424-П “The role of activation of the Wnt signaling cascade, the processes of its epigenetic regulation and immune-mediated inflammation in the progression of atherosclerosis and the possibility of influencing it by therapeutic neoangiogenesis in patients with stable coronary heart disease.”