Связь редких вариантов генов, ассоциированных с низкой костной массой и дислипидемиями, c сочетанием атеросклероза и остеопенического синдрома у женщин

Введение

Широко распространенные остеопороз (ОП) и атеросклероз (АС) являются хроническими неинфекционными заболеваниями и признаны важными проблемами общественного здравоохранения в мировом масштабе [1]. На сегодняшний день накоплен довольно большой объем научных данных, касающихся общих патогенетических механизмов этих заболеваний. Существует немало доказательств, что в сосудистой стенке и костной ткани происходят связанные метаболические процессы, которые, с одной стороны, приводят к остеопеническому синдрому, а с другой, к атеросклеротическому поражению и кальцификации сосудистой стенки. Для изучения этой связи была сформулирована концепция «костно-сосудистой оси», согласно которой между сосудистой стенкой и костью существует двунаправленный поток клеточных, эндокринных и метаболических сигналов, а нарушение этого взаимодействия при дисметаболических состояниях может приводить к одновременному развитию как сосудистой, так и скелетной патологии [2][3]. В последние годы ведется активный поиск биологических маркеров, которые бы позволили идентифицировать процессы АС и резорбции костной ткани на ранних стадиях их возникновения, и стратифицировать группы высокого риска осложнений. К общим факторам регуляции атеросклеротического процесса и костного ремоделирования относятся: лиганд активатора рецептора ядерного фактора каппа B (RANKL), остеопротегерин, остеокальцин, остеопонтин, склеростин, некоторые цитокины (в частности, интерлейкин 1, 6, 17), фактор некроза опухоли-α, остеонектин, эстрогены, паратгормон, общая щелочная фосфатаза, витамин К, матриксный Gla-протеин и катепсин К [4][5]. Проспективные исследования, подтверждающие устойчивую связь между минеральной плотностью кости (МПК) и параметрами сосудистой стенки [6-8], укрепляют предположение об общих молекулярных путях и едином генетическом контроле развития ОП и АС.

Известно, что АС и ОП являются классическими многофакторными, полигенными заболеваниями и развиваются в результате взаимодействия факторов окружающей среды и генов. В последнее десятилетие были выполнены различные исследования генов-кандидатов, контролирующих сочетанную патологию и обсуждались следующие полиморфизмы: рецептора витамина D (VDR), остеопротегерина (OPG), интерлейкина 6 (IL-6), WNT-сигнального пути (WNT16), трансформирующего фактора роста β1 (TGF-β1), рецептора липопротеидов низкой плотности (LRP6), аполипопротеина Е (APOE), коллагена 1 типа (COL1A), кальций-чувствительного рецептора (CASR) и рецепторов, вовлеченных в гомеостаз кальция, ароматазы (CYP19A1), трансмембранного белка Клото (klotho) [9]. При проведении полногеномного поиска GWAS (Genome-Wide Association Study) были выделены общие генные локусы, ассоциированные как с ОП, так и АС [10][11].

Генетическая структура ОП наряду с широко распространенными полиморфизмами, определяющими предрасположенность к первичному ОП, включает и редкие моногенные формы [12]. Современные методы идентификации генетических детерминант комплексных заболеваний демонстрируют максимальную эффективность при анализе крупных, тщательно фенотипированных выборок методом полногеномного поиска ассоциаций GWAS. Однако, для большинства комплексных признаков совокупный вклад идентифицированных генетических локусов объясняет лишь незначительную часть их наследуемости из-за их низкой статистической мощности для анализа редких аллелей. В соответствии с гипотезой «распространенное заболевание — редкий вариант», именно редкие варианты вносят существенный вклад в наследственную предрасположенность к мультифакториальным заболеваниям [13]. Хотя исследования, направленные на выявление ассоциаций редких вариантов с комплексными признаками, до настоящего времени остаются менее многочисленными по сравнению с GWAS, для большинства изученных фенотипов в них была продемонстрирована обратная корреляция между частотой аллеля в популяции и величиной его эффекта на признак: чем реже встречается вариант, тем выше его пенетрантность или вклад в фенотипическую изменчивость [13].

Таким образом, цель настоящего исследования — изучить связь редких вариантов генов моногенных заболеваний, сопровождающихся низкой МПК, дислипидемиями и АС, с сочетанной патологией костной и сердечно-сосудистой систем у женщин.

Материал и методы

Настоящее исследование базируется на двух клинических исследованиях: одномоментном и проспективном, выполненных в НМИЦ ТПМ с целью изучения связей между показателями субклинического АС, сосудистой жесткости и МПК. Одномоментное исследование по изучению ассоциаций субклинического АС сонных артерий, кальцификации коронарных артерий с МПК проводилось в 2018-2020 гг. [14]. В нем приняли участие 250 женщин в возрасте от 45 до 69  лет (средний возраст 58 [ 53; 62] лет) в период пери- и постменопаузы. Проспективное исследование было инициировано в 2012-1014 гг. (на базовом визите обследовано 107 женщин в постменопаузальном периоде в возрасте от 45 до 82 лет, средний возраст 54 [ 51; 60] года), повторный визит состоялся через 10 лет в 2022-2024 гг. (n=93, отклик 87%) [8][15][16]. В исследования не включали пациенток с любыми клиническими проявлениями АС, с заболеваниями, вызывающими вторичный ОП, получающих терапию, влияющую на костный обмен и на показатели сосудистой жесткости, перенесших оперативные вмешательства на позвоночнике и тазобедренных суставах, сопровождающиеся установкой металлоконструкций. Было проведено биобанкирование образцов крови участников обоих клинических исследований.

Оба исследования выполнены в соответствии с принципами Хельсинкской Декларации. Протоколы исследований одобрены этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ ТПМ» Минздрава России. Информированное согласие, в том числе на генетическое тестирование, подписывали в каждом исследовании. Дизайн, протоколы, общеклинические, лабораторно-инструментальные методы исследования и выполняемые процедуры были подробно описаны в предыдущих публикациях [8][14-16].

На основании двух клинических исследований сформирована новая электронная база данных, объектом настоящего исследования явились 308 женщин в возрасте от 45 до 82 лет.

Для анализа использовались индивидуальные тематические и амбулаторные карты пациентов, в которых была отражена информация о факторах риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и ОП, кардиоваскулярном риске и риске переломов, рассчитанных с помощью электронных версий шкал SCORE (Systematic Coronary Risk Evaluation) для стран с высоким риском ССЗ [17] и FRAX (Fracture risk assessment tool; Российская модель)¹, сопутствующих заболеваниях и принимаемых препаратах.

Для изучения ассоциаций генетических факторов с сочетанными изменениями в сосудистой стенке и костной ткани, были оценены следующие показатели: толщина комплекса интима-медиа и атеросклеротические бляшки (АСБ) сонных артерий, кальциевый индекс (КИ) коронарных артерий и МПК. За критерии субклинического АС принимали: наличие хотя бы одной АСБ в сонных артериях, КИ Агатстона ≥1 ед. Пациенты были разделены на 4 группы в зависимости от наличия или отсутствия перечисленных показателей.

Генетическое исследование выполнено у всех женщин и включало выделение ДНК из образцов цельной крови, хранящихся в биобанке ФГБУ «НМИЦ ТПМ» Минздрава России. Таргетное секвенирование выполнено на секвенаторе Nextseq550 (Illumina, США). Биоинформатический анализ данных проводился с применением специализированных программ: FastQC, Trimmomatic, Bwamem, Samtools, GATK и VEP. При анализе результатов в качестве референсной использовалась последовательность генома человека: Genome Reference Consortium Human Build 38. Для проведения анализа и реализации поставленных задач, из общего списка всех вариантов для каждого пациента проводился отбор редких и низкочастотных вариантов (частота минорного аллеля (МАF)<0,001), приводящих к изменению белок-кодирующей последовательности генов, связанных с моногенными заболеваниями, характеризующимися низкой МПК: BMP1, COL1A1, COL1A2, ALPL, ENPP1, SLC34A1, LRP5, WNT1, FBN1, TGFBR2, LMNA, NOTCH2, PLS3 и редких вариантов генов, связанных с моногенными дислипидемиями и АС: LDLR, APOE. В данную группу вариантов включались миссенс-замены, белок-укорачивающие варианты (преждевременный стоп-кодон, варианты со сдвигом рамки считывания, варианты, влияющие на сайты сплайсинга) и инсерции/делеции без сдвига рамки считывания в экзонах генов.

На основании литературных данных вышеуказанные гены были объединены в несколько генных сетей [18] и определялась сумма редких вариантов генов данных генных сетей (интегральный генетический фактор) в каждой подгруппе пациентов:

Е-ECM — сумма редких вариантов генов (BMP1, COL1A1, COL1A2) из генной сети, кодирующей внеклеточный матрикс (ECM — extracellular matrix);

Е-MIN — сумма редких вариантов генов (ALPL, ENPP1, SLC34A1) из генной сети, связанной с минерализацией костей (MIN — mineralization);

Е-WNT — сумма редких вариантов генов (LRP5, WNT1) из генной сети, связанной с сигнальным путем WNT;

Е-TGFB — сумма редких вариантов генов (FBN1, TGFBR2) из генной сети, связанной с сигнальным путем TGF-β;

Е-OTHER — сумма редких вариантов других генов (LMNA, NOTCH2, PLS3), связанных с низкой МПК;

Е-ALL — сумма редких вариантов во всех генах, связанных с моногенными заболеваниями с низкой МПК (BMP1, COL1A1, COL1A2, ALPL, ENPP1, SLC34A1, LRP5, WNT1, FBN1, TGFBR2, LMNA, NOTCH2, PLS3);

Е-ATHER — сумма редких вариантов в генах (LDLR, APOE), связанных с моногенными дислипидемиями и АС.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета прикладных статистических программ SAS (Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., USA). Для каждой из непрерывных величин, в связи с неправильным распределением признаков, представлены медианы и интерквартильный размах Me [Q25; Q75]. При оценке значимости межгрупповых различий у показателей, измеренных по интервальным шкалам, рассчитывали значения t-критерия Стьюдента и точного F-критерия Фишера. При оценке вклада генетических факторов в фенотипы было использовано логистическое регрессионное моделирование с расчетом многомерных пошаговых регрессий. При этом вычислялись отношения шансов (odds ratio) и отношение рисков (risk ratio) для показателей, которые отсутствовали в одной из сравниваемых групп, с 95% доверительным интервалом (ДИ). Статистически значимыми считались различия при р<0,05.

Результаты

Средний возраст пациенток составил 58 [ 51; 62] лет. Клиническая и лабораторно-инструментальная характеристики пациенток представлены в табл. 1.

В общей группе снижение костной массы (остеопения/ОП) было выявлено у 220 (71,4%), хотя бы одна АСБ была обнаружена у 181 (58,8%), депозиты кальция в коронарных артериях (КИ Агатстона ≥1 ед.) были выявлялены у 124 (49,6%) женщин. Среди изучаемых генетических показателей чаще встречались варианты генов SLC34A1 (6,5%), LDLR (3,3%), COL1A2 (2,3%), LRP5 (2,3%), COL1A1 (1,6%), APOE (1,6%), FBN1 (1,3%), суммарная частота вариантов для других генов была <1%. Суммарное бремя вариантов группы генов Е-ALL составило 23,7% и E-MIN — 8,4%, других изучаемых интегральных генетических факторов — <5%.

Для проведения сравнительного анализа изучаемых генетических вариантов в зависимости от состояния костной массы и признаков субклинического АС пациенты были разделены на 4 группы: I — нет АСБ и нет остеопении/ОП, II — есть АСБ и есть остеопения/ОП, III — есть АСБ и нет остеопении/ОП, IV — нет АСБ и есть остеопения/ОП. Аналогично сформированы 4 группы для другого изучаемого показателя доклинического АС — КИ Агатстона ≥1 ед.

Сочетания АСБ и КИ Агатстона ≥1 ед. со снижением костной массы отмечалось почти у половины пациентов (у 42,8% и 45,8%, соответственно). Не выявлено сочетания низкой МПК и признаков доклинического АС — наличия АСБ или КИ Агатстона ≥1 ед. — у 15% и 18,8% женщин, соответственно. У остальных участников суррогатные маркеры заболеваний регистрировались изолированно: наличие только низкой МПК или только признаков доклинического АС (АСБ или КИ ≥1 ед.)

В табл. 2 представлены результаты распределения генетических факторов в двух группах в зависимости от наличия и отсутствия сочетания субклинических признаков АС и ОП, достигшие статистической значимости.

В группе пациентов с сочетанием АСБ с низкой костной массой значимо чаще встречались генетические варианты гена SLC34A1 и суммарное бремя вариантов из групп генов E-ALL, E-TGFB в сравнении с группой без этой комбинации признаков. При сочетании КИ Агатстона ≥1 ед. и низкой МПК чаще регистрировались варианты гена APOE и суммарное бремя вариантов группы генов E-ALL в сравнении с группой без сочетания указанных признаков, однако для показателя Е-ALL значимость различий определялась на уровне тенденций (p=0,06).

Для всех остальных вариантов отдельных генов и групп генов не было статистически значимых различий в группах с наличием и без АС и остеопенического синдрома (как для АСБ, так и для КИ Агатстона ≥1 ед.).

В сравнительном межгрупповой анализе, в котором в качестве доклинического АС принята комбинация — наличие АСБ и/или КИ Агатстона ≥1 ед., показано, что в группе с этой комбинацией признаков АС и низкой МПК (частота выявления сочетаний 60,8%) только ген SLC34A1 (0% vs 7,2%, p=0,008) и варианты из трех групп генов E-ALL (9,7% vs 24,8%, p=0,047), E-MIN (0% vs 9,2%, p=0,003), E-TGFB (0% vs 4,6%, p=0,033) регистрировались значимо чаще в сравнении с группой без сочетанной патологии. Суммарное бремя вариантов группы генов E-ALL в зависимости от наличия субклинических признаков АС и ОП представлено на рис.

В рамках однофакторного анализа интегральный генетический фактор E-ALL ассоциировался с наличием сочетанной патологии костной ткани и сосудистой стенки и отношение шансов (OR) ее выявления составило 3,2 (95% ДИ [ 1,04-9,07], p=0,047). Поскольку ген SLC34A1 и интегральные генетические факторы E-MIN и E-TGFB не были выявлены у пациентов без сочетания субклинических проявлений АС и остеопенического синдрома, рассчитывалось отношение рисков (RR) и для SLC34A1 составило 1,2 (95% ДИ [ 1,12-1,28], p=0,008), для E-MIN — 1,2 (95% ДИ [ 1,12-1,29], p=0,003), для E-TGFB — 1,2 (95% ДИ [ 1,12-1,27], p=0,033).

В моделях многофакторного логистического регрессионного анализа, где прогнозируемым признаком было сочетание доклинических маркеров АС и ОП (АСБ и/или КИ Агатстона ≥1 ед. и остеопении/ОП), а предикторами — варианты из трех групп генов> E-ALL или E-MIN> или> E-TGFB, наряду с возрастом ≥55 лет, низкой массой тела (индекс массы тела <20 кг/м²), повышенной толщиной комплекса интима-медиа (≥0,9 мм), повышенными общим холестерином (≥5,0 ммоль/л) и маркером костной резорбции CTx (>1,008 нг/мл), кардиоваскулярным риском по SCORE ≥1%, риском переломов по FRAX для основных остеопоротических переломов ≥7% и для перелома бедра ≥0,3%, не была подтверждена независимая ассоциация ни одного из изучаемых интегральных генетических факторов с сочетанием АС и остеопенического синдрома. Значимыми предикторами сочетанной патологии во всех проверяемых моделях являлись клинические факторы: возраст, повышенная толщина комплекса интима-медиа, повышенный холестерин и риск переломов по FRAX (табл. 3).

Обсуждение

Вклад генетических факторов в развитие возраст-ассоциированных хронических заболеваний, таких, как ОП и ССЗ, важен, так как имеет потенциальное значение для их прогнозирования, течения и терапии. Поскольку ОП и АС являются сложными многофакторными заболеваниями, проведенные на сегодняшний день исследования генов- кандидатов и полногеномные ассоциативные исследования дают неоднозначные и, порой, противоречивые результаты, несмотря на достаточно хорошую воспроизводимость последних [19]. Имеются данные о феномене «потерянной наследуемости» [13], согласно которому частые генетические варианты, выявленные в исследованиях геномных ассоциаций GWAS, определяют небольшую долю наследуемости мультифакториальных заболеваний. Одна из теорий, объясняющих этот феномен — «модель редких аллелей», предполагает, что большая часть генетической основы распространенных сложных фенотипов определяется редкими вариантами с частотой минорного аллеля (МАF) <1%, но обладающими относительно высокой пенетрантностью [13][20]. В проведенном исследовании впервые оценивалась связь редких генетических вариантов с развитием сочетанной патологии ОП и АС, базируясь на изучении генов, связанных с моногенными заболеваниями, приводящими к снижению МПК, развитию дислипидемий и субклинического АС. Для этого из литературных источников были отобраны гены, связанные с моногенными заболеваниями, характеризующимися низкой МПК: BMP1, COL1A1, COL1A2, ALPL, ENPP1, SLC34A1, LRP5, WNT1, FBN1, TGFBR2, LMNA, NOTCH2, PLS3, моногенными дислипидемиями и АС: LDLR, APOE. В когорте женщин в пери- и постменопаузе остеопения/ОП встречались у двух третей, а сочетание низкой МПК и субклинического АС зарегистрировано почти у половины пациентов. В общей группе из изучаемых генетических показателей чаще встречались SLC34A1 — ген, отвечающий за перенос фосфатов через мембраны клеток почек и обеспечивающий фосфатный гомеостаз (6,5%), LDLR — ген рецептора холестерина липопротеидов низкой плотности (3,3%), COL1A2 — ген, кодирующий альфа 2 цепь белка коллагена 1 типа (2,3%), LRP5 — ген, контролирующий передачу сигналов по WNT/b-катаниновому пути (2,3%). В связи с относительной малочисленностью вариантов в изучаемых генах для усиления статистической мощности варианты генов были объединены и суммированы по принципу вхождения в генные сети, среди которых суммарное бремя вариантов из групп генов Е-ALL и E-MIN составило 23,7% и 8,4% соответственно, других изучаемых интегральных генетических факторов — <5%. Наша когорта формировалась из пациенток, пришедших на прием к ревматологу или эндокринологу (к специалистам по ОП), и охватывала широкий спектр пациентов с различной тяжестью или отсутствием остеопенического синдрома, параллельно пациентки были обследованы в отношении субклинического АС. Специалисты по орфанным заболеваниям или генетики не участвовали в наборе пациентов. Примечательно, что для других фенотипов опорно-двигательного аппарата при обследовании гетерогенных когорт частота обнаружения мутаций в генах составляла около 20% [21], что согласовывалось с частотой выявления интегрального генетического фактора E-ALL в нашей группе.

В сравнительном межгрупповом анализе пациентов с сочетанием АСБ с низкой костной массой значимо чаще встречались ген SLC34A1 и интегральные генетические факторы Е-ALL, Е-TGFB в сравнении с группой без данной комбинации признаков. При сочетании КИ Агатстона ≥1 ед. и низкой МПК только ген APOE встречался статистически значимо чаще, а показатель E-ALL не достигал статистической значимости (p=0,06) в сравнении с группой без сочетания этих признаков. При использовании комбинации АСБ и/или КИ Агатстона ≥1 ед. было показано, что сочетание этих признаков АС и низкой МПК значимо ассоциировалось с геном SLC34A1 и тремя интегральными генетическими факторами E-ALL, E-MIN, E-TGFB.

При оценке вклада генетических и клинических факторов в развитие сочетанной патологии ОП и АС с помощью многофакторного логистического регрессионного анализа, продемонстрированная отчетливая тенденция в ассоциации выше упомянутого гена SLC34A1 и интегральных генетических факторов E-ALL, E-MIN, E-TGFB с сочетанной патологией не была подтверждена, возможно из-за детерминации МПК и показателей субклинического АС другими генами или их совокупностями, или доминирования клинических факторов, таких как: возраст ≥55 лет, повышенная толщина комплекса интима-медиа, повышенный общий холестерин и риск переломов по FRAX над генетическими, или относительно небольшого числа пациентов, включенных в исследование.

Поскольку в выявлении распространенных неинфекционных заболеваний основную роль играет оценка вероятности развития заболевания, то для прогнозирования абсолютного сердечно-сосудистого риска или риска переломов были разработаны специальные шкалы или электронные калькуляторы SCORE или FRAX, основанные на валидированных клинических факторах риска, но они не учитывают персональные генетические данные и их можно использовать только у лиц после 40 лет. В последнее время все чаще для оценки предрасположенности к заболеваниям используют шкалы генетического риска (ШГР), основанные на отборе вариантов нуклеотидных последовательностей, относящихся к определенным патологическим процессам. В проведенном нами ранее исследовании были оценены три европейские шкалы, показавшие связь с МПК и остеопоротическими переломами, и продемонстрирована их ассоциация с наличием АСБ и депозитов кальция в коронарных артериях у женщин в пери- и постменопаузе [22]. По-видимому, объединенная информация о большом количестве вариантов нуклеотидных последовательностей, сосредоточенная в ШГР дает больше возможностей для прогнозирования комплексных многофакторных заболеваний и обуславливает большую чувствительность метода ШГР по сравнению с исследованием генов-кандидатов или GWAS. Полученные результаты создают предпосылки для индивидуализации генетических факторов, одновременно ответственных за предрасположенность к развитию ССЗ и ОП, и создание комбинированных ШГР, имеющих важное значение для одновременной оценки риска и профилактики обоих заболеваний.

Ограничением исследования является небольшой> объем выборки для молекулярных исследований, что не позволило достичь статистической мощности. Связь между генетическими факторами и сочетанными изменениями сосудистой стенки и костной ткани изучалась только у женщин в пери- и постменопаузе и не оценивалась у молодых женщин и мужчин.

Заключение

Выявлена отчетливая тенденция к повышению частоты интегральных генетических факторов, представляющих сумму редких вариантов генов, связанных с моногенными заболеваниями с низкой МПК, у пациентов с сочетанием АС и остеопенического синдрома, которая не достигала статистической значимости, вероятно, из-за недостаточной численности участников или преобладания клинических факторов риска. Возможно, создание комбинированных ШГР на основе частых и редких вариантов откроет горизонты для прогнозирования сочетанной патологии и ее своевременной профилактики.

Отношения и Деятельность. Статья выполнена в рамках государственного задания «Разработка комплексной системы оценки общих ранних маркеров и прогностических факторов остеопороза и атеросклероза у женщин».

Relationships and Activities. State assignment "Development of a comprehensive assessment system for common early markers and prognostic factors of osteoporosis and atherosclerosis in women".